渭源縣黃芪根腐病病原菌的分離與鑒定

陳健 孫旭春 趙慶芳

摘要：對從甘肅省渭源縣采集到的黃芪根腐病病株進行了病原菌的分離、純化和致病性檢測，并對致病菌形態(tài)學進行了觀察，結合核糖體DNA（rDNA） ITS序列分析的分子生物學鑒定，以明確引起黃芪根腐病的致病病原菌。結果表明：黃芪根腐病致病菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）瘤座孢目（Tuberculariales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的4個種。共分離出16個菌株，經(jīng)檢測有5個菌株具有致病性，均屬鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporun）1株（9號菌株），腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）2種（12號菌株和16號菌株，其中16號菌株可能為腐皮鐮刀菌的變種），銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）1株（15號菌株），待定鐮刀菌1株（14號菌株，與三線鐮刀菌的同源性僅為88%）。

關鍵詞：黃芪;根腐病;致病菌鑒定;ITS序列分析;渭源縣

中圖分類號：S512.1? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）10-0021-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.005

Abstract：The root rot strains of Astragalus membranaceus root rot symptom collected from Weiyuan County， Gansu Province were isolated， purified and tested for pathogenicity， and by morphological identification and identification of pathogenic bacteria with molecular identification of ribosomal DNA（rDNA） ITS sequence analysis， so as to identify pathogenic bacteria of causing Astragalus membranaceus root rot. The results show that the pathogen of root rot of astragalus membranaceus was four species of Deuteromycotina， Hyphomycetes， Tubercuariles， Tuberculariaceae， Fusarium， a total of 16 strains were isolated， and 5 strains were detected to be pathogenic， all of which were fusarium， of which 1 strain（strain 9） was Fusarium oxysporum， 2 strains of （strains 12 and strains 16 of which may be a variant of Fusarium solani） were Fusarium solani， 1 strain（strain 15） was Fusarium acuminatum， 1 strain（strain 14， only 88% homologous to Fusarium trichomonas） was determined Fusarium.

Key words：Astragalus membranaceus;Root rot;Pathogenic bacteria identification;ITS sequences analysis;Weiyuan County

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科多年生草本植物，以根入藥，是藥用價值很高的中藥材[1 - 3 ]。近年來隨著市場需求量的持續(xù)增加，黃芪種植面積不斷擴大，使得輪作周期縮短，重茬和迎茬面積增加，導致黃芪根腐病危害逐年加重，嚴重影響其產(chǎn)量和質量。

黃芪根腐病屬于土傳病害，是土壤中的病原菌和病原線蟲共同作用的結果，鐮刀菌是引起黃芪根腐病的主要致病菌[4 - 6 ]，目前對黃芪根腐病致病菌的分類鑒定主要集中在形態(tài)方面，而利用ITS序列分析對引起黃芪根腐病的致病菌進行分子生物學方面的鑒定目前還尚未見報道。核糖體DNA（rDNA）-ITS序列在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內不同菌株間卻高度保守，所以ITS序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異。此外ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[7 ]。我們對從甘肅省定西市渭源縣黃芪大田采集到的黃芪根腐病病株進行病原菌的分離、純化和致病性檢測，以確定引起黃芪根腐病的致病菌，并通過形態(tài)學鑒定，結合核糖體DNA（rDNA）-ITS序列分析的分子生物學鑒定，以明確引起黃芪根腐病的致病病原菌的分類地位。

1? ?材料與方法

1.1? ?病樣采集

從甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)黃芪種植地采集黃芪根腐病帶病植株。采集地為平川地，選取5塊種植地，每塊地采集3個病株。選根腐病發(fā)生比較嚴重的黃芪植株為供試樣本。

1.2? ?病原菌分離純化

采用組織分離法分離黃芪根腐病病原 菌[8 ]。將初步分離所得菌株配制成孢子懸浮液（孢子濃度為10×40倍鏡下每視野約為5～10個孢子），取1 mL混勻至PDA培養(yǎng)基中在25 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)基上長出單個菌落時觀察每個菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌絲的結構。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上每個菌落的特征一致則確定該菌株為純種，并轉接試管斜面4 ℃保存;如果觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上菌落的特征不一致，需再次純化，直至培養(yǎng)基上菌落特征一致。

1.3? ?病原菌致病性檢測

黃芪種子經(jīng)催芽消毒后種植于盆內，待子葉完全舒展、長出4～6片真葉時采用根部切傷接種法[8 ]。將病原菌孢子懸浮液（孢子濃度10×40倍鏡下每視野約為50～60個孢子） 2 mL滴加到植株附近土壤中，每盆選取兩處空隙共加入4 mL孢子懸浮液，黑暗培養(yǎng)24 h，然后正常光照培養(yǎng)。每個菌株接種3盆，以無菌水處理作為對照，觀察對黃芪幼苗的致病情況。以幼苗根部腐爛、地上部分枯死為標準判定該幼苗發(fā)病，計算幼苗發(fā)病率（%）和病情指數(shù)（DI）。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調查株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=[∑（V·f）/（m·N）]×100%

其中，V為該嚴重度的級值，f為該級病株數(shù)，m為最高級值，N為調查發(fā)病總株數(shù)。根腐病分級標準：0級，沒有病害癥狀;1級，1%～25%植株受到損害;2級，26%～50%植株受到損害;3級，51%～75%植株受到損害;4級，76%～100%植株受到損害。

1.4? ?致病菌的形態(tài)鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊》所描述的無性器官形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀對致病菌菌落、菌絲體、孢子體等進行形態(tài)鑒定，鑒定到種[9 ]。

1.5? ?致病菌的分子生物學鑒定

1.5.1? ? 致病菌總DNA的提取? ? 將活化的致病菌接入100 mL真菌液體培養(yǎng)基I中，恒溫培養(yǎng)5～7 d，真空抽濾得到干燥菌絲體。采用改良的真菌DNA提取方法提取黃芪根腐病致病菌總DNA[10 ]。以DS2000為DNA Marker，在含0.5 μg/mL EB的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳60 min（120 V），電泳緩沖液為0.5×TBE溶液，檢測DNA質量。在凝膠圖像分析系統(tǒng)中照相。

1.5.2? ? 致病菌核糖體DNA（rDNA）- ITS片段的PCR擴增? ?采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)ITS通用引物ITSl和ITS4[11 ]，對提取DNA中ITS和5.8S rDNA（ITS包括18S rDNA和5.8S rDNA之間的轉錄間隔區(qū)ITSl與5.8S rDNA和28S rDNA之間的轉錄間隔區(qū)ITS2）進行PCR擴增。PCR擴增體系為25μL：水13.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mM）1.5 μL，dNTP（各2 mM）2 μL，Taq（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物 （20 μM） 各1.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預熱5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后于72 ℃延伸10 mins，溫度降至10 ℃反應完畢。反應結束后，取5 μL反應物在含0.5 μg/mL EB的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳60 min（120 v），以DS 2000為DNA Marker，電泳緩沖液為0.5×TBE溶液，檢測PCR產(chǎn)物大小。在凝膠圖像分析系統(tǒng)中照相。

1.5.3? ? PCR擴增產(chǎn)物的純化? ? 采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）對擴增產(chǎn)物進行純化。

1.5.4? ? ?ITS片段的測序及序列分析? ? 將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術服務有限公司，做雙向測序。將所測ITS序列用Seqman軟件（DNAsrar）拼接。采用Clustal X 1.83軟件將拼接后的ITS序列與GenBank中檢索已知的標準菌株的ITS序列片段多序列比對，進行同源性比較，使用MEGA（Version 4.0）軟件分析，采用最小進化法 （Minimum Evolution theord，ME）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步確定致病菌的類別和分類地位。

2? ?結果與分析

2.1? ?分離結果

從黃芪根腐病患病植株中得到36株分離物，通過觀察菌落特征、菌落形態(tài)、菌絲顏色、菌絲分泌的色素在PDA培養(yǎng)基上形成的顏色及顯微鏡下孢子體結構和大小，確定有16種分離物，初步確定為半知菌綱叢梗孢目瘤座孢科鐮刀菌屬真菌。

2.2? ?致病性檢測

致病性檢測結果（表1）表明，9號菌株、12號菌株、14號菌株、15號菌株、16號菌株均具有致病性（發(fā)病率超過25%，病情指數(shù)在16以上），黃芪幼苗的發(fā)病率分別為32.45%、30.65%、29.55%、40.15%、28.57%，病情指數(shù)均在16以上。其中15號菌株發(fā)病率最高，為40.15%，病情指數(shù)為20.31。發(fā)病黃芪癥狀與田間植株自然發(fā)病癥狀一致，從發(fā)病黃芪幼苗和土壤中進行病原菌地再分離，均能得到引起黃芪幼苗發(fā)病的病原菌，確定該5個菌株為黃芪根腐病致病菌。

2.3? ?形態(tài)鑒定

經(jīng)形態(tài)學鑒定，9號菌株菌落白色絮狀，菌絲較長，致密，中間或邊緣有明顯的隆起，菌落背面米白色。分生孢子梗無色，頂生卵形、鐮刀形分生孢子。大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，稍彎曲，兩端漸窄，具鉤狀，具1～5隔膜，多為3隔膜;厚垣孢子頂生，橢圓形或球形，平滑。初步確定為尖孢鐮刀菌（Fusarium. oxysporum）。12號菌株菌落土灰色至淡粉色，由內向外出現(xiàn)環(huán)狀顏色變化，中間有微黃色的斑點，無隆起，生長較均勻，菌落背面淡黃色和乳黃色;分生孢子梗單瓶梗狀，伸長不分枝;大型分生孢子紡錘形、香腸型，短而胖，稍彎曲，兩端較鈍，有3～5個隔膜，多數(shù)為3隔;小型分生孢子橢圓形、腎形，單細胞無色;厚垣孢子間生，球形，表面光滑。初步確定為腐皮鐮刀菌（Fusarium. solani）。14號菌株菌落乳白色、白色，菌絲較短，短絨狀，氣生菌絲不發(fā)達，中間有明顯的隆起;菌落背面為淺黃色。分生孢子梗螺旋式伸長、不分枝。大型分生孢子兩端尖削或頂端尖，紡錘形至鐮刀形彎曲或端直，具2～5隔，多數(shù)為3隔。小型分生孢子數(shù)量少，梭形至腎臟形，單胞，無隔膜，厚垣孢子橢圓形，表面光滑，間生于菌絲中間。由于無明顯的結構特征，從形態(tài)學只能初步確定為鐮刀菌屬中的1種。15號菌株菌落白色至淡黃色，菌絲較厚，致密，絨狀;菌落背面為橘黃色，有明顯的菌圈;分生孢子梗螺旋狀，單瓶梗;小型分生孢子數(shù)量少，呈梭形、長橢圓形、腎形或卵形，單細胞，有1～2個隔;大型分生孢子細鐮刀形，彎曲度大，向兩端漸趨尖削，具3～5隔，多數(shù)為3隔;厚垣孢子串生與菌絲中間。初步確定為銳頂鐮刀菌。16號菌株分生孢子梗伸長，單瓶梗狀，較長;大型分生孢子數(shù)量多，紡錘形或鐮刀形，稍彎曲，兩端較鈍圓，有3～5個隔，多數(shù)為3隔;小型分生孢子數(shù)量多，長橢圓形、卵形，單細胞，無分隔;厚垣孢間生，單生，橢圓形或圓形，表面光滑;菌落白色，菌絲較稀薄，平鋪，菌絲較長，生長較均勻;菌落背面中間為淡黃色，邊緣為乳白色。其形態(tài)特征跟12號菌株相似，菌落形狀和顏色有差別，較難判定，可能為腐皮鐮刀菌（Fusarium. solani）的變種。

2.4? ?ITS序列分析

2.4.1? ? 致病菌DNA提取及檢測結果? ? 如圖1所示，5種致病菌的DNA提取結果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后未出現(xiàn)拖尾等現(xiàn)象，濃度跟標準Maker濃度相比無顯著差異。DNA質量和濃度均可滿足下一步試驗。

2.4.2? ? 致病菌ITS片段的擴增? ? 采用真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4對5種致病菌的ITS片段進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2。從圖2可以看出，5個菌株擴增后均產(chǎn)生穩(wěn)定的條帶，條帶均在500～750 bp。

2.4.3? ? ITS序列分析? ? 對PCR產(chǎn)物進行純化后，將純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行ITS序列雙向測序，雙向測序結果經(jīng)SeqMan軟件拼接并輸出全序列，9號菌株、12號菌株、14號菌株、15號菌株和16號菌株的rDNA-ITS序列長度分別為486 bp、 502 bp、510 bp、516 bp、536 bp。經(jīng)DNAMAN軟件多序列分析，對5個菌株核糖體DNA ITS片段序列的拼接結果在Genbank 中進行同源性比較，其中與9號菌株同源性最高的ITS序列菌株全部為尖孢鐮刀菌，其同源性均為100%，可以確定9號菌株為尖孢鐮刀菌;15號菌株核糖體DNA- ITS序列與Genbank中銳頂鐮刀菌的同源性均為99%，僅有1個堿基的差異，可以確定15號菌株為銳頂鐮刀菌;12號菌株和16號菌株與其同源性最高的ITS序列菌株全部為腐皮鐮刀菌（茄腐鐮刀菌），與它們的同源性為99%，僅有1個堿基的差異，后經(jīng)DNAMAN軟件比對，發(fā)現(xiàn)12號菌株和16號菌株的同源性為85.89%。確定12號菌株和16號菌株同為腐皮鐮刀菌（茄腐鐮刀菌），由于其形態(tài)特征有差異，初步認為16號菌株可能是腐皮鐮刀菌的一個變種。與14號菌株同源性高的ITS序列菌株均為三線鐮刀菌，但其同源性最高為88%，無法確定到種。

使用多序列比對分析軟件Clustal X軟件（Version 1.83）將5個菌株的rDNA-ITS序列與從Genbank中下載的尖孢鐮刀菌、腐皮鐮孢菌、銳頂鐮孢菌、三線鐮刀菌等標準菌株的rDNA-ITS序列進行序列的聯(lián)配比較（Alignment），序列最后以Clustal格式輸出。選擇絲孢綱瘤座孢目瘤座孢科擬黑粉菌屬（Ustilaginoidea）作為外類群，使用MEGA（Version 4.0）軟件進行分析，采用最小進化法（Minimum Evolution theord，ME）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，應用自展（Bootstrap）分析法進行檢驗，共循環(huán)1 000次 （圖3） 。

由圖3可以看出，9號菌株與5株尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的親緣關系最近，聚為一小分支，其Bootstrap的支持率為99%;12號菌株與10株腐皮鐮孢菌（茄腐鐮孢菌）（F. solani）親緣關系最近，Bootstrap的支持率為99%。此外，ITS系統(tǒng)發(fā)育樹表明，16號菌株與12號菌株的關系較近，它們聚為一組，處于同一個分支下，其Bootstrap的支持率為99%;15號菌株與5株銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）的ITS序列無明顯差異，聚為一小分支，Bootstrap的支持率為99%，同時發(fā)現(xiàn)它與三線鐮刀菌（F. tricinctum）的親緣關系也比較近，處于同一分支下，其Bootstrap的支持率也為99%。14號菌株同源性高的ITS序列菌株均為三線鐮刀菌，但其同源性最高僅為88%，在構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，14號菌株與處于銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和三線鐮刀菌（F. tricinctum）的分支親緣關系最近，聚為一小分支，Bootstrap的支持率僅為54%。由可以認為，9號菌株為尖孢鐮刀菌，12號菌株和16號菌株為腐皮鐮刀菌，15號菌株為銳頂鐮刀菌，14號菌株與銳頂鐮刀菌和三線鐮刀菌的親緣關系都比較近，具體屬于哪一類鐮刀菌，需做進一步鑒定。

3? ?結論與討論

很多病原菌能夠引起植物根腐病，已報道的有鐮刀菌、絲核菌、腐霉等。在鐮刀菌屬（Fusarium）真菌中，有許多是危害經(jīng)濟作物的重要病原菌，它們是植物維管束系統(tǒng)的寄生菌，在適宜的環(huán)境條件下，不但破壞作物的輸導組織維管束，還在菌體生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質，嚴重時可導致產(chǎn)量顯著下降[12 ]。梁巧蘭等[13 ]報道，尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌是引起觀賞百合根腐病的主要致病菌。李敏權等[14 ]對甘肅中部干旱地區(qū)苜蓿根腐病進行了分離鑒定，確認在該地區(qū)苜蓿根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和半裸鐮刀菌。本試驗研究通過采集帶病的黃芪根腐病植株，依據(jù)組織分離法對黃芪根腐病的病原菌進行了分離、純化，分離得到的病原菌通過回接的致病性檢測，14 d后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，癥狀與田間癥狀相同，而對照組不發(fā)病。根據(jù)致病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀的觀察結果，再結合核糖體DNA（rDNA）ITS序列測定的結果，將致病菌鑒定為半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）瘤座孢目（Tuberculariales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、 腐皮鐮孢菌（F. solani）和銳頂鐮孢菌（F. acuminatum）。其中銳頂鐮孢菌的致病力最強，接種后發(fā)病率最高為40.15%;尖鐮孢菌的致病力較弱，接種后發(fā)病率為32.45%;腐皮鐮孢菌的致病力最弱，接種后發(fā)病率為28.57%～30.65%。鄧成貴[4 ]、王立新等[15 ]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪根腐病病原菌經(jīng)分離、致病性測定和形態(tài)學鑒定初步確定為腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，本研究從分子生物學水平進一步鑒定出引起黃芪根腐病的致病菌為腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和銳頂鐮刀菌。

為了進一步驗證分離出的致病菌，我們對形態(tài)上已初步確定的5種致病菌的核糖體DNA-ITS序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)9號菌株的致病菌尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和12號菌株、16號菌株的腐皮鐮刀菌（F. solani）與GenBank中的F. oxysporum和F. solani、F. acuminatum同源性都很高，同源性分別為100%和99%，系統(tǒng)發(fā)育樹上Bootstrap的支持率為99%。由于形態(tài)學上有差異，16號菌株的致病菌可能為腐皮鐮刀菌的變種，需做進一步鑒定。15號菌株的致病菌與GenBank中F. acuminatum的同源性也在99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹與銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）的親緣關系也比較近，其Bootstrap的支持率也為99%，可確定15號菌株為銳頂鐮刀菌。Renske Landeweert等[16 ]認為，通過ITS區(qū)域比對，序列相似性大于99%，可鑒別為相同種;序列相似性大于95%且小于99%，可鑒別為相同屬;序列相似性小于95%，可鑒別為相同科。14號菌株的致病菌其序列與標準菌株三線鐮刀菌ITS序列的最高同源性僅為88%。在構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，14號菌株與處于銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和三線鐮刀菌（F. tricinctum）的分支親緣關系最近，聚為一小分支，Bootstrap的支持率僅為54%。由于其同源性小于95%，故14號菌株具體為鐮刀菌屬哪一種，有待于進一步研究。

雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定與分子鑒定和種間系統(tǒng)發(fā)育分析之間常常存在著不一致的情況[17 ]，但在本研究中，尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和銳頂鐮刀菌ITS序列的同源性比較結果表明同源性對比的結果和形態(tài)學鑒定的結果是一致的，證明ITS序列對于真菌鐮刀菌屬種間鑒定是可行的，可以作為快速檢測、鑒定鐮刀菌的方法。

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（本文責編：鄭立龍）