hPlGF-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對皮膚創(chuàng)傷修復及血管形成的作用研究

陳金逸 陳宗存 饒朗毓 黃亞蓮 符茂雄

[摘要]目的：構建胎盤生長因子hPlGF-2基因腺病毒載體，探討hPlGF-2修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）對SD大鼠皮膚愈合的影響。方法：分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs細胞，PCR 法擴增hPlGF-2基因DNA片段，并構建pAdTrack-hPlGF-2重組載體;重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染 BMSCs后，倒置顯微鏡觀察EGFP表達情況，PCR與Western blot分別檢測hPlGF-2 mRNA和蛋白的表達，MTT法檢測BMSCs增殖;構建SD大鼠皮膚割傷模型，以創(chuàng)緣注射感染重組腺病毒pAd/hPlGF-2的 BMSCs為實驗組，以創(chuàng)緣注射生理鹽水為對照組，HE染色觀察創(chuàng)面病理形態(tài)變化，免疫組織化學法檢測帶EGFP（+）的BMSCs在創(chuàng)面的分布情況。結果：成功構建了腺病毒載體 pAdTrack-hPlGF-2，在hPlGF-2基因修飾的BMSCs中檢測到了hPlGF-2 mRNA與蛋白的表達，且感染重組腺病毒pAd/hPlGF-2對BMSCs的增殖能力無影響。在大鼠皮膚創(chuàng)面注射hPlGF-2基因修飾的BMSCs后，創(chuàng)面感染程度較輕，愈合速度較快，在創(chuàng)傷后7d和14d觀察到EGFP標記的BMSCs出現(xiàn)在創(chuàng)面血管周圍和血管內(nèi)皮處，同時有FⅧ表達。在創(chuàng)傷后7d新生肉芽組織中，bFGF的表達明顯增加。結論：hPlGF-2基因修飾的BMSCs能分化為成纖維細胞參與到皮膚創(chuàng)面修復中，并分化為血管內(nèi)皮細胞參與血管的再生。

[關鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞;腺病毒載體;重組質(zhì)粒;胎盤生長因子;基因修飾;創(chuàng)傷愈合

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）10-0106-05

Eeffect of hPlGF-2 Gene Modified BMSCs on Skin Wound Repair

and Angiogenesis

CHEN Jin-yi，CHEN Zong-cun，RAO Lang-yu，HUANG Ya-lian，F(xiàn)U Mao-xiong

（Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，Hainan，China）

Abstract： Objective? An adenoviral vector of placental growth factor hPlGF-2 gene was constructed， and the effect of hPlGF-2 modified bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on skin healing in SD rats was investigated. Methods? Isolate and culture SD rat BMSCs cells， amplify the hPlGF-2 gene DNA fragment by PCR， and construct the pAdTrack-hPlGF-2 recombinant vector; After infecting BMSCs with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2， observe the expression of EGFP by an inverted microscope. PCR and Western blot were used to detect the expression of hPlGF-2 mRNA and protein. MTT method to detect BMSCs proliferation; A model of SD rat skin cut was established. BMSCs infected with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2 were injected into the wound margin as the experimental group， and saline was injected into the wound margin as the control group. HE staining was used to observe the pathological changes of the wound. The distribution of BMSCs with EGFP（+） on the wound was detected by immunohistochemistry. Results? The adenoviral vector pAdTrack-hPlGF-2 was successfully constructed， hPlGF-2 mRNA and protein expression was detected in hPlGF-2 gene-modified BMSCs， and infection with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2 had no effect on the proliferation capacity of BMSCs. After injecting hPlGF-2 gene-modified BMSCs into rat skin wounds， the wound infection was milder and healed faster. EGFP-labeled BMSCs were observed around the blood vessels and endothelial endothelium at 7 and 14 days after trauma. At the same time， FVIII is expressed. The expression of bFGF was significantly increased in the new granulation tissue at 7 days after wounding. Conclusion? The hPlGF-2 gene-modified BMSCs can participate in the repair of skin wounds. It is speculated that they differentiate into vascular endothelial cells and participate in the regeneration of blood vessels.

Key words： bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）; adenovirus vector; recombinant plasmid; placental growth factor? （PlGF）; gene modification; wound healing

由于創(chuàng)傷、放射或遺傳性疾病等各種原因導致的皮膚缺損，創(chuàng)面局部微環(huán)境較差，導致創(chuàng)面感染、愈合延遲、難愈或不愈等，是臨床治療面臨的一大難題[1-3]。創(chuàng)面愈合過程與多種因素有關，并涉及細胞分子之間的復雜相互作用[4]。而在創(chuàng)面愈合時新生血管形成十分重要，血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）具有較強的促血管再生與神經(jīng)再生功能，是研究較早且較為成熟的一種促血管生長因子[5-6]。對VEGF家族的另一成員，即胎盤生長因子（PLGF），也具有強烈的促進血管生長的作用，且作用效果更為持久，而關于hPLGF2在皮膚損傷后血管形成方面的相關研究尚未見報道。

骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是來源于中胚層且具有分化能力的干細胞，在一定誘導條件下BMSCs具有向成骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞以及基質(zhì)細胞等中胚層細胞分化的能力[7]。目前，已有諸多研究證明，BMSCs對骨、肌肉、心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷均具有促修復的作用[8-10]。隨著研究的深入，BMSCs在創(chuàng)面愈合中的作用越來越受到關注，BMSCs能夠分泌與創(chuàng)面愈合有關的細胞因子或分化為創(chuàng)面修復細胞等機制能夠發(fā)揮促進創(chuàng)面愈合的作用[9，11-12]。本研究擬通過構建腺病毒載體pAdTrack-hPlGF2，探討hPLGF2基因修飾的BMSCs在損傷后的大鼠皮膚血管形成中的作用及其可能機理，這將有助于為臨床創(chuàng)面愈合治療提供新思路。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶與Percoll 分離液購于美國Sigma公司;鼠抗EGFP、兔抗FⅧ、兔抗bFGF、兔抗hPlGF-2、兔抗GAPDH、鼠抗兔TRITC、山羊抗鼠FITC，羊抗兔 IgG等抗體購于美國Millipore公司;Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ酶、 pTG19-T表達載體和pAdTrack-CMV 穿梭載體購于美國Invitrogen公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于瑞士Roche公司;反轉錄試劑盒、Tag酶、感受態(tài)大腸桿菌 DH5α購于日本Takara公司;Lipofectamine2000、MTT試劑盒，HE染色試劑盒與RIPA 裂解液購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 動物：SPF級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（100±10）g購于海南醫(yī)學院動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)：頸椎脫臼處死成年SD大鼠并取雙側脛骨和股骨，使用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，在懸液加入含Percoll分離液，1 000rpm離心10min后，吸取白膜層并加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液，棄懸浮細胞，之后每隔3d更換一次培養(yǎng)液。當細胞生長融合達培養(yǎng)瓶90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。本實驗使用第三代BMSCs。

1.2.2 hPlGF-2基因表達腺病毒載體的構建：①hPlGF-2基因的克隆、克隆載體pTG19-T/hPlGF-2的構建與鑒定：設計 hPlGF-2基因的擴增引物，上游：5-CTGTCTGCTGGGAACAACTCAA-3，下游：5'-TCCTTTCTGCCTTTGT CGTCTC-3'，以pBLAST49-hPlGF-2質(zhì)粒為模板，PCR擴增hPlGF-2基因片段。將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，將產(chǎn)物與pTG19-T表達載體連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，并將陽性克隆送至上海生物工程有限公司進行測序鑒定，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒命名為pTG19-T/hPlGF-2;②hPlGF-2基因腺病毒pAdTrack-CMV穿梭載體的亞克隆及鑒定：腺病毒穿梭載體 pAdTrack-CMV與pTG19-T/hPlGF-2經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ切割后，回收產(chǎn)物后連接，轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α內(nèi)，挑取抗性克隆，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒，進行雙酶切（Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ）與測序鑒定，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒命名為 pAdTrack-hPlGF-2。

1.2.3 重組腺病毒的包裝和病毒滴度的測定：pAdTrack-hPlGF-2載體質(zhì)粒經(jīng)Pme Ⅰ酶線性化后，轉入含pAdTrack質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌 DH5α中進行同源重組，得到的重組腺病毒命名為pAd/hPlGF-2，用Pac Ⅰ酶切pAd/hPlGF-2病毒質(zhì)粒，并進行電泳檢測，利用酚氯仿抽提法純化質(zhì)粒。以轉染試劑Lipofectamine2000介導純化的pAd/hPlGF-2質(zhì)粒轉染293T細胞進行包裝，轉染5h后去除含病毒培養(yǎng)基，更換新鮮10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察293T細胞病變情況。當細胞有明顯病變時，將上清液收集于離心管中，37℃和-80℃反復凍融3次，12 000r/min離心5min，收集上清，繼續(xù)轉染293T細胞。經(jīng)8輪傳代擴增，將第8代病毒以倍比稀釋法測定病毒滴度。

1.2.4 重組腺病毒感染BMSCs：將BMSCs以每孔6×106個接種于6孔板，每孔加入滴度7×109 PFU/ml的重組腺病毒pAd/hPlGF-2 500μl，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后棄病毒液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況并拍照。

1.2.5 PCR反應：使用TIRzol試劑盒提取感染后BMSCs的總RNA，以總RNA為模板進行反轉錄，通過PCR法在mRNA水平檢測hPlGF-2基因的表達情況，以空病毒pAdTrack-CMV感染48h的BMSCs總RNA為模板的檢測作為對照。擴增結束后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.6 Western blot檢測：RIPA裂解緩沖液提取感染后BMSCs的總蛋白，BCA法進行蛋白濃度測定，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，切膠并轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入兔抗hPlGF-2（1：1 000）、兔抗GAPDH（1：1 000）在4℃下孵育過夜。PBS洗滌PVDF膜后，將其與HRP 標記的二抗（1：5 000）常溫孵育1h，洗膜并滴加ECL發(fā)光液進行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.2.7 MTT法：將正常BMSCs、pAdTrack-CMV空載體感染的BMSCs及重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs，以每孔1×105個接種于96孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，在培養(yǎng)24、36、48、72、96h加入0.5%二苯基溴化四氮唑藍（MTT）混合均勻，繼續(xù)孵育6h后每孔加入二甲基亞砜（DMSO），使用酶標儀測定波長490nm處的光密度（OD）值。

1.2.8 大鼠切割傷模型制備：SD大鼠以0.4%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，背部皮膚去毛，使用0.5%碘伏消毒，在大鼠背部兩側分別切除部分全層皮膚，達深筋膜，直徑在1.2cm左右，建立全層皮膚損傷模型。模型完成后，取200μl重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs懸液局部多點注射至創(chuàng)緣，對照組大鼠在相同部位注射等量的生理鹽水。

1.2.9 HE染色：造模致傷后7d、14d，在無菌條件下取創(chuàng)緣及正常交界處組織，PBS沖洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后，制成4μm的石蠟組織切片，蘇木精染色5min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3min，脫水、透明、封片，于電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10 免疫組織化學：造模致傷后7d取創(chuàng)緣新生肉芽組織制成常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水，3% H2O2+甲醇溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01mol/L枸椽酸鹽緩沖液95℃水浴30 min進行抗原修復，待冷卻至室溫后加第一抗體鼠抗EGFP（1：100）、兔抗FVIII（1：100），兔抗bFGF（1：500） 4℃過夜，PBS 沖洗，加第二抗體鼠抗兔TRITC（1：200）、山羊抗鼠FITC（1：200）或羊抗兔 IgG（1：1 000）室溫孵育30min后：①PBS沖洗，加DAPI復染細胞核，封片，在熒光顯微鏡下觀察EGFP和FVIII表達并拍照;②PBS沖洗，加DAB顯色后，經(jīng)蘇木素復染，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察bFGF表達并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 重組腺病毒載體pAdTrack-hPlGF-2的獲得與鑒定：PCR擴增獲得長度為921bp的hPlGF-2基因片段，該片段插入pTG19-T載體克隆后，將酶切獲得的hPlGF-2基因片段與pAdTrack-CMV穿梭載體連接得到的重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，電泳條帶中有一條大小為921bp，表明重組腺病毒載體pAdTrack-hPlGF-2構建成功。見圖1。

2.2 重組腺病毒pAd/hPlGF-2的包裝和病毒滴度的測定：重組腺病毒pAd/hPlGF-2經(jīng)293T細胞包裝24 h后，倒置熒光顯微鏡觀察見明顯的 EGFP表達，包裝后7d，胞體腫脹變圓、核增大（見圖2）。病毒細胞經(jīng)8輪傳代與擴增以提高其滴度，以倍比稀釋方法檢測到病毒滴度為7×109TU/ml。

2.3 重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs后EGFP表達檢測：如圖3所示，重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs 48h后，倒置熒光顯微鏡觀測到未感染pAd/hPlGF-2病毒的正常BMSCs不表達EGFP，經(jīng)pAd/hPlGF-2病毒感染的BMSCs中EGFP的明顯表達。

注：A.正常BMSCs細胞;B.經(jīng)重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染48h的BMSCs細胞

2.4 重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs后hPlGF-2 mRNA和蛋白水平檢測：以感染重組腺病毒pAd/hPlGF-2 48h的BMSCs總RNA為模板，在mRNA水平檢測到 hPlGF-2基因片段的表達，而在空病毒感染的BMSCs中未檢測到表達（見圖4）。同樣，在感染重組腺病毒pAd/hPlGF-2 48h的BMSCs檢測到了hPlGF-2蛋白的表達，而在空病毒感染的細胞中未檢測到（見圖5）。

2.5 重組腺病毒pAd/hPlGF-2對BMSCs增殖能力的影響：MTT法檢測正常組、空載體組及重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染組細胞增殖能力，結果顯示，三組細胞的光密度值均隨著時間的延長出現(xiàn)遞增的趨勢（見圖6）。數(shù)據(jù)分析結果表明，重組腺病毒感染組與正常組、重組腺病毒感染組和空載體組之間相比較，細胞增殖能力無顯著性差異（P>0.05），見表1。說明感染重組腺病毒pAd/hPlGF-2對BMSCs的生長無刺激或抑制作用。

2.6 hPlGF-2基因修飾BMSCs對皮膚愈合的影響：大鼠皮膚創(chuàng)傷造模后7d和14d均觀察到：注射重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs懸液的創(chuàng)面肉芽組織豐富，創(chuàng)緣開始有較厚的新生表皮向創(chuàng)面移行生長;而對照組肉芽組織含量相對較少，創(chuàng)面無明顯愈合現(xiàn)象（見圖7）。說明注射重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs后加速了創(chuàng)面愈合。

注：A.注射生理鹽水的創(chuàng)面（對照組）;B.注射重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs懸液的創(chuàng)面

第7天和第14天，在創(chuàng)緣新生肉芽組織切片中可見 EGFP的陽性細胞，同時觀察到FⅧ的陽性細胞，并且多數(shù)聚集在真皮層、血管周圍及血管內(nèi)皮處（見圖8）。說明移植的BMSCs可以在創(chuàng)面定植，并分化為能夠表達FⅧ的血管內(nèi)皮細胞。

在第7天觀察到對照組和實驗組都有bFGF表達，但與對照組相比，注射重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs懸液的新生肉芽組織中的bFGF表達較為顯著（見圖9）。說明BMSCs 在創(chuàng)面定植并可以分化為成纖維細胞，以促進創(chuàng)面愈合。

3? 討論

皮膚創(chuàng)面愈合是一個復雜的生物學過程，分為炎癥反應、肉芽組織增生、創(chuàng)面再上皮化及創(chuàng)面愈合后的改建等過程[13]。局部給予外源性生長因子在創(chuàng)面愈合環(huán)境中呈現(xiàn)出半衰期短、生物利用度低、成本高、需重復給藥等缺點，隨著細胞分子生物學、組織工程學及DNA分子操作技術的進步，通過基因治療的方法有望為慢性創(chuàng)面的修復帶來新的曙光[14-15]。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）具有強大的可塑性，來源廣泛，容易體外大量擴增以及基因修飾，其在慢性難愈創(chuàng)面的治療作用也逐漸受到廣泛關注。

基因修飾的BMSCs不僅能夠提供治療性的修復細胞，而且能夠為傷口的正常愈合提供所必需的細胞因子[16]。目前許多研究證實，全身或局部應用BMSCs可以顯著提高創(chuàng)面愈合速度和質(zhì)量。例如，Mcfarlin[17]等將BMSCs局部移植到大鼠全層切割傷創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，BMSCs組顯著增強了創(chuàng)面?zhèn)谟纤俣?。在局部?chuàng)面微環(huán)境的刺激下，BMSCs能表達一些特定的細胞因子，從而調(diào)節(jié)修復細胞的趨化、增殖以及新生血管形成等來參與創(chuàng)面修復[18]。而且，BMSCs較容易被重組腺病毒轉染。腺病毒用作基因治療載體，具有穩(wěn)定安全，致病性低，基因容量大，插入位點少，易于大量培養(yǎng)與純化、感染宿主細胞的類型廣等特點[19-20]。本次研究成功克隆了hPlGF-2基因ORF片段，并將此目的片段連接到了pTG19-T載體上以擴增目的片段。隨后通過pAdTrack-CMV腺病毒構建系統(tǒng)，成功的構建了重組腺病毒載體pAdTrack-hPlGF-2。經(jīng)包裝的pAd/hPlGF-2在熒光顯微鏡下能觀察到明顯的EGFP表達。為了驗證腺病毒pAd/hPlGF-2可靠性，將其感染大鼠BMSCs 48h后，在mRNA和蛋白水平均證明hPlGF-2可以成功的過表達。并觀察轉染過腺病毒的BMSCs狀態(tài)良好，未發(fā)生形變且有EGFP表達。在不同感染時間檢測BMSCs增殖能力發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染對BMSCs的生長無刺激或抑制作用。

為了驗證hPlGF-2基因修飾的BMSCs在血管形成的作用，構建了皮膚割傷模型，在創(chuàng)緣注射了重組腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs懸液，觀察hPlGF-2基因修飾的BMSCs在創(chuàng)傷的分布及作用情況。本研究中，hPlGF-2基因修飾的BMSCs表達增強型綠色熒光蛋白（EGFP），在第7天可觀察到綠色熒光細胞分布在創(chuàng)面血管周圍，到14d仍可觀察到綠色熒光，同時，在創(chuàng)傷后7d和14d也均觀察到血管內(nèi)皮細胞表面標志物FⅧ的表達。表明BMSCs能夠在創(chuàng)面微環(huán)境中定植，并愈合過程中向血管內(nèi)皮細胞直接轉化。堿性成纖維細胞因子bFGF作為重要的促有絲分裂因子，主要功能包括作為血管生長因子和促進創(chuàng)傷愈合與組織修復[21]。通過bFGF染色后發(fā)現(xiàn)在hPlGF-2基因修飾的BMSCs注射的新生肉芽組織中bFGF的表達明顯增加。bFGF主要分布在成纖維細胞的胞漿中[22]，因此推測BMSCs在局部微環(huán)境作用下可能直接分泌細胞外基質(zhì)參與修復或演變成修復的成纖維細胞。

通過本研究，成功構建了重組腺病毒載體pAdTrack-hPlGF-2并成功制備了hPlGF-2基因修飾的BMSCs，初步驗證了在大鼠皮膚創(chuàng)傷面注射hPlGF-2基因修飾的BMSCs可能會加快皮膚愈合。hPlGF-2基因修飾的BMSCs有望應用于促進血管新生、改善創(chuàng)面愈合治療中。

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[收稿日期]2020-03-09

本文引用格式：陳金逸，陳宗存，饒朗毓，等.hPlGF-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對皮膚創(chuàng)傷修復及血管形成的作用研究[J].中國美容醫(yī)學，2020，29（10）：106-111.