環(huán)孢素A導致牙齦增生患者治療前后齦溝液TH1/TH2/TH17細胞因子變化研究

柳惠榮

[摘要] 目的 研究環(huán)孢素A導致牙齦增生（CIGH）患者治療前后齦溝液（GCF）TH1/TH2/TH17細胞因子濃度變化及其意義。 方法 選取2014年7月～2019年11月就診于我院口腔科門診的21例CIGH患者，同期19名健康志愿者作為對照。記錄健康志愿組及CIGH組治療前后牙齦增生指數(shù)，收集齦溝液，采用流式微球技術（CBA）應用流式細胞儀測定健康志愿組及CIGH組辛伐他汀凝膠治療3個月前后齦溝液TH1/TH2/TH17細胞因子濃度。 結果 辛伐他汀凝膠治療總有效率為76.2%。治療前CIGH組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度與健康志愿組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和 IFN-γ 5種細胞因子濃度與健康志愿組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。7種細胞因子濃度在CIGH患者1級增生組與2級增生組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。辛伐他汀凝膠治療前，有效組和無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度與健康志愿組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ 5種細胞因子濃度與健康志愿組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;有效組與無效組齦溝液中7種細胞因子濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。有效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度治療前后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與健康志愿組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度治療前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），治療后與健康志愿組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ 5種細胞因子濃度兩組治療前后比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結論 齦溝液中IL-6和TNF-α增高是促進CIGH發(fā)生的部分原因，局部給予辛伐他汀治療可以降低齦溝液IL-6和TNF-α濃度，改善患者牙齦增生狀況。

[關鍵詞] 牙齦增生;環(huán)孢素A;TH1/TH2/TH17細胞因子;流式微球技術;齦溝液

[中圖分類號] R781.42;R780.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）27-0005-05

[Abstract] Objective To study the changes and significance of TH1/TH2/TH17 cytokine concentration in gingival crevicular fluid （GCF） of patients with cyclosporin A-induced gingival hyperplasia（CIGH） before and after treatment. Methods A total of twenty-one patients with CIGH who were treated in the outpatient of the department of stomatology in our hospital from July 2014 to November 2019 were selected. Nineteen healthy volunteers were selected as the control in the same period. The gingival hyperplasia index of healthy volunteers and CIGH group before and after treatment was recorded. The gingival crevicular fluid was collected. The cytometric bead array（CBA） was used to measure 3 simvastatin gel treatments of healthy volunteer group and CIGH group using flow cytometry The concentration of TH1/TH2/TH17 cytokines in gingival crevicular fluid around month. Flow cytometric bead array（CBA） was used to measure the TH1/TH2/TH17 cytokine concentration in gingival crevicular fluid before and after 3 months of simvastatin gel treatment in healthy volunteer group and CIGH group. Results The total effective rate of simvastatin gel treatment was 76.2%. The concentration of IL-6 and TNF-α in the gingival crevicular fluid of the CIGH group before the treatment were significantly differentces from those of the healthy volunteer group（P<0.05）. While there were no statistically significant differences in the concentration of IL-2， IL-4， IL-10， IL-17A and IFN-γ between the CIGH group and the healthy volunteer group（P>0.05）. There was no significant difference in the concentration of 7 cytokines between grade 1 hyperplasia group and grade 2 hyperplasia group in CIGH patients（P>0.05）. Before simvastatin gel treatment， the concentration of IL-6 and TNF-α in the gingival crevicular fluid of the effective group and the ineffective group were statistically differentces from those of the healthy volunteer group（P<0.05）， while IL-2 and IL-4， IL-10， IL-17A and IFN-γ concentrations were not statistically differentces from those of the healthy volunteer group（P>0.05）. The difference was not statistically significant in 7 cytokine concentrations in gingival crevicular fluid between the effective group and the ineffective group（P>0.05）. After treatment， the differences in the concentration of IL-6 and TNF-α in gingival crevicular fluid of the effective group before and after treatment were statistically significant（P<0.05）. And the difference was not statistically significant compared with the healthy volunteer group（P>0.05）. The IL-6 and TNF-α concentrations in the gingival crevicular fluid of the non-effective group had no statistically significant differences before and after treatment（P>0.05）. There was a statistically significant difference after treatment of the non-effective group compared with the healthy volunteer group（P<0.05）. IL-2， IL-4， IL-10， IL-17A and IFN-γ concentrations of 5 cytokines before and after treatment had no significant differences between the two groups（P>0.05）. Conclusion The increase of IL-6 and TNF-α in gingival crevicular fluid is part of the reason for promoting the occurrence of CIGH. Local administration of simvastatin can reduce the concentration of IL-6 and TNF-α in gingival crevicular fluid and improve the gingival hyperplasia of patients.

[Key words] Gingival hyperplasia; Cyclosporin A; TH1/TH2/TH17 cytokines; Cytometric bead array; Gingival crevicular fluid

藥物性牙齦增生是指服用某些藥物為主要因素而誘發(fā)的牙齦體積增大，出現(xiàn)乳頭狀和牙齦緣增厚病變形成小葉，牙齦堅韌，呈分葉狀覆蓋牙面。在組織學特征方面主要為上皮細胞和固有層成纖維細胞增多、細胞外基質和膠原纖維成分增多，并伴有不同程度的炎癥浸潤[1]。環(huán)孢素A是臨床上應用廣泛的一種免疫抑制劑，導致牙齦增生是其常見的不良反應，發(fā)病機制不明，影響患者的生活質量，目前尚無有效的治療措施，因此對其發(fā)病機制的研究逐漸增多。細胞因子是由免疫細胞（如T細胞、B細胞、單核巨噬細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。細胞因子在牙齦增生的發(fā)病過程中起一定作用[2-3]。本研究應用流式微球技術（Cytometric bead array，CBA）即微量樣本多指標流式蛋白定量技術，采用流式細胞儀測定環(huán)孢素A導致的牙齦增生（Cyclosporin A-induced gingival hyperplasia，CIGH）患者齦溝液（Gingival crevicular fluid，GCF）中TH1/TH2/TH17細胞因子（包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和 IFN-γ共7種）濃度，探討治療前后細胞因子濃度的變化趨勢，有利于更深入了解CIGH的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2014年7月～2019年11月就診于我院口腔科門診的由環(huán)孢素A導致牙齦增生患者21例，男12例，女9例，中位年齡34（14～61）歲;以同期我院健康志愿者19名作為健康志愿組，男11例，女8例，中位年齡35（14～62）歲。所有研究對象均簽署知情同意書。健康志愿者牙周組織健康，牙齦顏色正常，無紅腫出血，牙槽骨無吸收。納入標準：服用環(huán)孢素A持續(xù)時間1個月以上，近3個月內未服用過任何抗生素。排除標準：牙周膜來源的腫瘤;牙槽骨增生引起的牙齦假性增生;其他原因導致的牙齦增生，如遺傳性牙齦纖維瘤病等?；颊叻铆h(huán)孢素A的基礎疾病為慢性血液系統(tǒng)疾病，包括慢性再生障礙性貧血、免疫性血小板減少癥、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、自身免疫性溶血性貧血。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器? 雙激光四色FACSCalibur流式細胞儀（Becton，Dickinson and Company公司，美國），TH1/TH2/TH17細胞因子檢測試劑盒（江西諾德醫(yī)療器械有限公司，中國），AE 240 電子天平（梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司，中國），Whatman-3MM層析濾紙（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，中國）。

1.2.2 臨床檢查? 檢查口腔牙齦的顏色形態(tài)質地、牙齦增生指數(shù)（Gingival hyperplasia index，GHI）。GHI分級標準參考文獻[4]。0級：無牙齦增生，附著齦緊貼牙槽骨，齦表面可呈小的點坑狀，無或有輕微的肉芽顆粒，齦乳頭的齦端呈刃狀，牙齦的密度和體積無增加;1級：牙齦增生早期，表現(xiàn)為牙齦密度增加，齦表面有明顯的顆粒和肉芽，探診深度≤3 mm，齦乳頭圓鈍;2級：中度牙齦增生，齦乳頭增大和（或）齦緣翻卷，探診深度≤6 mm，從肥大牙齦的頂端外側測量，頰舌向厚度達2 mm，齦緣的外形線為凹形或較平直，齦乳頭在一定程度上可從牙面掀開;3級：牙齦增生顯著，覆蓋部分臨床牙冠，探診深度>6 mm，從肥大牙齦的頂端外側測量，頰舌向厚度達3 mm，齦緣的外形線為凸形而不是凹形，齦乳頭可從牙面掀開;4級：重度牙齦增生，表現(xiàn)為牙齦厚度明顯增加，大部分臨床牙冠被覆蓋，其余數(shù)值同3級，齦乳頭可從牙面掀開，探診深度>6 mm，齦頰舌向厚度達3 mm。

1.2.3 牙齦增生患者治療? 對患者進行口腔健康知識宣教，教授患者正確的口腔健康行為等。局部給予辛伐他汀凝膠每日1次，3個月后評價療效。辛伐他汀凝膠制備方法：84 mg辛伐他汀加入2 mL蒸餾水中攪拌均勻后為溶液A，105 mg甲基纖維素加入5 mL蒸餾水中在50℃～60℃攪拌，為溶液B，在制備溶液B過程中加入溶液A，形成均勻凝膠后0.1 mL辛伐他汀凝膠含有1.2 mg辛伐他汀。使用時將0.1 mL辛伐他汀凝膠注入牙周袋內，囑患者勿食堅硬食物。

1.3 療效評價標準

參考文獻[4]，GHI由高向低轉變?yōu)橛行?，無變化或向高轉變?yōu)闊o效。

1.4 齦溝液收集

將Whatman-3MM層析濾紙剪裁為6個10 mm×2 mm的濾紙條，每4條放入一個Eppendorf（Ep）管中，編號后用AE 240電子天平稱重后備用。采集牙齦增生最嚴重的受試牙的齦溝液，在唇舌側近遠中軸角處將濾紙條輕輕插入齦溝內，至稍遇阻力，放置30 s后取出，如有血跡和唾液污染則棄之不用，重新取樣，放回原Ep管中封存，即刻稱重，用取液后Ep管的質量減去取液前Ep管的質量，按濃度（約1 g/L）換算成體積，即可得到齦溝液的體積數(shù)。Ep管于-20℃保存。

1.5 TH1/TH2/TH17細胞因子濃度檢測

樣本測試前解凍樣本，按所得差值用去離子水稀釋10倍后，以2400 g離心20 min，取上清液備測。應用CBA技術，采用流式細胞儀測定健康志愿者及CIGH患者治療前后齦溝液TH1/TH2/TH17細胞因子濃度，按照試劑盒操作說明書進行操作。每個樣本管中加入25 μL捕獲微球混合液200 g離心5 min，吸去上清，加入等體積的微球緩沖液，混勻后室溫避光30 min，加入待測樣本和熒光檢測試劑各25 μL，充分混勻后室溫避光孵育2.5 h。之后加入1 mL PBS溶液，200 g離心5 min，吸去上清，再加入0.3 mL PBS溶液上機檢測。流式細胞儀上應用CELLQuest 軟件進行數(shù)據(jù)獲取，CBA分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用正態(tài)檢驗分析所有數(shù)據(jù)分布情況，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用One-way ANOVA單因素方差分析比較各組指標間的差異，組間兩兩比較采用Scheffe差別檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 辛伐他汀凝膠治療CIGH患者效果

在使用環(huán)孢素A的74例慢性血液系統(tǒng)疾病患者中，21例患者出現(xiàn)牙齦增生，發(fā)生率為28.4%。使用環(huán)孢素A至出現(xiàn)牙齦增生為時間為2～7個月，就診時牙齦增生程度1級9例，2級12例。辛伐他汀凝膠治療后1級有效者7例，2級有效者9例，總有效率為76.2%。

2.2 治療前CIGH組與健康志愿組齦溝液TH1/TH2/TH17細胞因子濃度比較

與健康志愿組相比，治療前CIGH組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與健康志愿組相比，IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和 IFN-γ 5種細胞因子濃度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。7種細胞因子濃度在牙齦增生患者1級增生組與2級增生組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 CIGH患者治療前后有效組與無效組齦溝液TH1/TH2/TH17細胞因子濃度比較

7種細胞因子濃度在牙齦增生患者1級增生組與2級增生組相比，差異無統(tǒng)計學意義，兩組合并后比較治療前后數(shù)據(jù)。辛伐他汀凝膠治療前，有效組與無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度與健康志愿組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ 5種細胞因子濃度與健康志愿組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。有效組與無效組齦溝液中7種細胞因子濃度相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。治療后，有效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度與治療前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與健康志愿組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度治療前后相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），治療后與健康志愿組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ 5種細胞因子濃度兩組治療前后相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

環(huán)孢素A是常用的免疫抑制劑，其導致牙齦增生的發(fā)生率可達33.3%，可能與遺傳易感性、牙齦炎癥、藥物代謝及牙齦膠原合成降解不平衡等有關，牙齦增生后容易出血、影響美觀，嚴重者影響咀嚼功能，降低患者生活質量，研究牙齦增生的發(fā)病機制有助于開展針對性治療[5]。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A增加牙齦成纖維細胞表達抗凋亡基因Bcl-2，表達內質網(wǎng)應激標志物如CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）和線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP），發(fā)揮抗凋亡作用，促進牙齦增生[6]。將Wistar大鼠分為環(huán)孢素組、結扎組、環(huán)孢素+結扎組處理，60 d后測定增生組織增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達情況，環(huán)孢素+結扎組PCNA表達最高，表明牙齦炎癥也促進環(huán)孢素A誘導的牙齦增生[7]。體外培養(yǎng)原代牙齦成纖維細胞，加入濃度為1 mg/mL的環(huán)孢素A 16 h，測定細胞外基質與黏附分子途徑相關的57個基因表達情況，編碼細胞黏附蛋白E-cadherin的基因CDH1表達上調，而幾乎所有細胞外基質金屬蛋白酶（MMP8、MMP11、MMP15、MMP16、MMP24、MMP26）表達下調，表明環(huán)孢素A通過抑制金屬蛋白酶分泌，導致牙齦結締組織的細胞外基質成分積聚而致牙齦增生[8]。對藥物（環(huán)孢素A、苯妥英鈉和硝苯地平）誘導的牙齦增生患者的增生組織進行免疫組化染色，結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）表達增高[9]。細胞因子變化在牙齦增生過程中發(fā)揮一定作用，環(huán)孢素A可通過介導牙齦成纖維細胞的細胞周期蛋白B1表達導致細胞過度生長誘發(fā)牙齦增生[10]。對體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細胞在受到環(huán)孢素A刺激后產(chǎn)生IL-6，并促進IL-6生成，與環(huán)孢素A存在濃度和時間相關性[2]。在腎移植后使用環(huán)孢素A治療的患者中，牙齦增生組齦溝液IL-6 及其家族成員抑瘤素M（Oncostatin M）濃度增高，與牙齦局部炎癥程度不相關，推測IL-6家族成員在牙齦增生過程中發(fā)揮一定作用[3]?？焖龠M展性牙周炎患者齦溝液中TNF-α水平增高，與炎癥浸潤廣泛，袋上皮的增生與潰瘍顯著相關。TNF-α 促進成纖維細胞增殖，環(huán)孢素A與TNF-α 有協(xié)同作用。

本研究結果顯示，在血液系統(tǒng)疾病使用環(huán)孢素A的74例患者中，21例患者出現(xiàn)牙齦增生，發(fā)生率為28.4%。患者就診時牙齦增生程度主要為1級、2級，牙齦增生程度較輕可能與患者依從性較好，能夠按照醫(yī)囑每1～2個月隨訪有關，能夠及時發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A相關不良反應。牙齦增生及治療后消退是一個相對較慢的過程，參考其他研究治療時間，定為3個月，總有效率達到76.2%，取得一定治療效果。CBA技術是一個基于流式細胞檢測系統(tǒng)的多重蛋白定量檢測方法，是能夠同時對單個樣品中的多個指標進行檢測的新型分析技術。與ELISA法測定細胞因子相比，具有高通量、高特異性、高靈敏性、操作簡便、低成本、重復性好、檢測時間短等優(yōu)勢，成為一種新的細胞因子檢測方法，越來越多的應用于各個領域。本研究應用CBA技術同時測定7種細胞因子，發(fā)現(xiàn)就診時CIGH組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度增高，且1級增生組與2級增生組之間相比，差異無統(tǒng)計學意義，而IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和 IFN-γ 5種細胞因子濃度與健康志愿組相比，差異無統(tǒng)計學意義。對1級增生組與2級增生組數(shù)據(jù)合并后進行分析，治療前有效組和無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度較健康志愿組明顯增高，而有效組與無效組齦溝液中7種細胞因子濃度相比，差異無統(tǒng)計學意義，給予辛伐他汀凝膠治療3個月后，有效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度可以降至正常水平，而無效組齦溝液中IL-6和TNF-α濃度治療前后變化不明顯，仍高于正常。IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A和IFN-γ 5種細胞因子濃度治療前后無明顯變化，推測齦溝液中IL-6和TNF-α濃度增高在CIGH發(fā)生早期發(fā)揮一定促進作用。

目前包括環(huán)孢素A在內的藥物性牙齦增生仍缺乏有效的治療手段，一般為菌斑控制、去除局部刺激因素及切除手術等，可以取得一定的治療效果[11]。停用環(huán)孢素A可以有效減輕牙齦增生，但本研究患者使用環(huán)孢素A的基礎疾病主要為慢性血液系統(tǒng)疾病，使用環(huán)孢素A常常是治療這類疾病的有效措施，因牙齦增生而停藥或減少劑量的方法不可行。另外，患者往往出現(xiàn)血小板計數(shù)明顯減少，各種操作后出血危險性增加，不適合采用牙周治療及切除手術，對這一類患者需探索其他治療手段。在小鼠動物模型中，阿奇霉素和甲硝唑能夠抑制環(huán)孢素A誘導的牙齦增生[12]。近期一項薈萃分析表明，在環(huán)孢素A誘導的牙齦增生患者中，使用阿奇霉素有助于抑制環(huán)孢素A誘導的牙齦增生[13]。但由于阿奇霉素和甲硝唑與環(huán)孢素A存在藥物相互作用，可以導致環(huán)孢素A濃度增高[14]，增加肝腎功能損害等嚴重不良反應的可能性，不利于調整環(huán)孢素A用量，因此這一部分患者臨床應用阿奇霉素存在一定的風險。在2型糖尿病合并慢性牙周炎的患者中，齦溝液IL-6、TNF-α和內脂素濃度增高，給予口服辛伐他汀治療可以降低這些細胞因子濃度，減輕牙周炎癥狀[15]。而局部使用辛伐他汀凝膠同樣可以降低齦溝液中IL-6和IL-8濃度，減輕慢性牙周炎患者的炎癥反應[5]。由于在慢性血液系統(tǒng)疾病患者使用環(huán)孢素A的同時，往往還加用其他藥物如達那唑等，考慮到辛伐他汀的血液系統(tǒng)藥物不良反應，以及與其他藥物的相互作用，采用局部給藥方式以減少藥物劑量，有利于減少不良反應，推測其作用機制可能是降低齦溝液中的IL-6和TNF-α濃度。鑒于環(huán)孢素A導致的牙齦增生發(fā)病機制復雜，需要進一步研究，如最新CBA方法可同時測定12種細胞因子（包括TH1/TH2/TH17細胞因子和單核巨噬細胞分泌的細胞因子），探討其他細胞因子在發(fā)病過程中所起的作用;辛伐他汀凝膠局部給藥的其他作用機制也需要進一步探討。對于辛伐他汀治療無效者需要探索其他的治療方法，包括調整辛伐他汀凝膠濃度、延長用藥時間、聯(lián)合用藥、試用中藥等?？祻托乱旱闹饕煞质敲乐薮篌固崛∥?，具有通利血脈，養(yǎng)陰生肌的功效。一項研究表明，固定矯治中的牙齦炎患者齦溝液的IL-6和TNF-α濃度增高，局部給予康復新液治療后，IL-6和TNF-α濃度降低，牙齦炎好轉[16]，但是其對于包括環(huán)孢素A在內的藥物性牙齦增生的治療效果有待于深入研究。本研究患者牙齦增生程度較輕，對于3級和4級患者來說，這些細胞因子的變化如何，辛伐他汀凝膠局部給藥療效如何，均需要進一步研究。

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（收稿日期：2020-06-03）