葛根素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖和活性的影響及其作用機(jī)制

方志輝 張?zhí)熹h

(湖北省十堰市國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院創(chuàng)傷外科，十堰市 442000，電子郵箱：payuv97@163.com)

骨質(zhì)疏松是一種全身代謝性疾病，近年來(lái)我國(guó)骨質(zhì)疏松患者人數(shù)逐年增加[1]。骨質(zhì)疏松的主要特征是骨量減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退行性變化，骨脆性增加[1]。有研究表明，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在各種類(lèi)型骨質(zhì)疏松中都會(huì)發(fā)生不同程度的成骨細(xì)胞凋亡，而成骨細(xì)胞可促進(jìn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)與核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)分泌，起到間接調(diào)控破骨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[2]。臨床上治療骨質(zhì)疏松的藥物主要是抑制骨吸收，但是對(duì)骨形成作用效果不明顯[3]。葛根素通過(guò)影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而對(duì)骨細(xì)胞分化起到一定的促進(jìn)作用[4]。從強(qiáng)直性脊柱炎患者和股骨頸骨折患者髖關(guān)節(jié)囊組織中分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的研究中，葛根素能抑制正常成纖維細(xì)胞和強(qiáng)直性脊柱炎患者成纖維細(xì)胞的增殖和成骨性分化[5]。王曉暉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以有效改善糖尿病骨質(zhì)疏松患者的臨床癥狀，并且不良反應(yīng)較少，治療效果顯著。葛根素治療老年女性骨質(zhì)疏松癥的效果也較為突出，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖也有一定的促進(jìn)作用[7]，但是關(guān)于其作用機(jī)制的相關(guān)研究較少。本研究探討葛根素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖和活性的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24只無(wú)特定病原體級(jí)別的3月齡且未經(jīng)產(chǎn)的SD雌性大鼠，體重(210.5±10.2)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境室溫維持在(25±1)℃，空氣相對(duì)濕度(52±3)%，通風(fēng)設(shè)置8～12次/h，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 葛根素注射液(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20046426)；RANKL抗體(武漢博士德公司提供,批號(hào)BAl323)、核因子κB受體活化因子[receptor activator of nuclear factor-κB，RANK；艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab219097]、OPG多克隆抗體(Abbkine公司，批號(hào)：ABP52083)；磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-Tween，PBST；蘇州亞科科技股份有限公司，批號(hào)：H0012)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立：選取6只大鼠作為正常組，其余18只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低劑量葛根素組和高劑量葛根素組，每組6只。根據(jù)文獻(xiàn)[8]中的方法制作骨質(zhì)疏松大鼠模型。使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，約10 min后，待大鼠明顯活動(dòng)減弱、呼吸均勻、觸碰四肢無(wú)反抗，即可將大鼠背部朝上四肢固定。剔除背部毛發(fā)，用碘附常規(guī)消毒腰背部，再用酒精棉球脫碘附，在肋脊角水平位置，沿與正中腰部平行且距離正中線(xiàn)約2 mm處，左右對(duì)稱(chēng)分別做一小切口(約3 mm)。切開(kāi)肌肉進(jìn)入后腹膜并且沿子宮分支找出卵巢，在輸卵管處結(jié)扎卵巢動(dòng)靜脈切除卵巢，行背式卵巢去勢(shì)。依次縫合肌層及皮層，碘附消毒，待大鼠完全清醒后，放回鼠籠，觀察建模情況。大鼠運(yùn)動(dòng)量明顯減少，在等同外力下模型大鼠出現(xiàn)乏力，抽筋、骨折，則視為建模成功。其中建模成功15只，模型組、低劑量葛根素組及高劑量葛根素組各5只。

1.3.2 干預(yù)方法：建模成功后，低葛根素組、高劑量葛根素組分別給予50 mg/kg和75 mg/kg葛根素注射液皮下注射干預(yù)，正常組、模型組大鼠給予等體積的生理鹽水皮下注射干預(yù)。4組大鼠干預(yù)均1 d/次，連續(xù)干預(yù)3周。在干預(yù)過(guò)程中均正常飼養(yǎng)，自由飲水。

1.3.3 成骨細(xì)胞培養(yǎng)：干預(yù)3周后，采用斷頭法處死大鼠，放置于75%的酒精中浸泡10 min后在無(wú)菌條件下揭去頭皮，取顱蓋骨，清除表面結(jié)締組織，之后使用生理鹽水沖洗至發(fā)白，剪碎后使用5 mL 0.25%胰蛋白酶消化20 min；棄去消化液，骨片移至0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液中消化60 min，然后棄去消化液，再次將骨片移至0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液中消化60 min；將過(guò)濾后的消化液2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，將沉淀的細(xì)胞加入至5 mL杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)皿中，在37℃、含5%二氧化碳、濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后DMEM換液一次，將不貼壁的細(xì)胞清除，之后2～3 d換液一次，純化成骨細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代待用。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖：將純化第3代的成骨細(xì)胞再傳1代后，使用0.25%胰蛋白酶以及0.02%乙二胺四乙酸消化計(jì)數(shù)，按2×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板內(nèi)，加入含10%小牛血清的5 mL DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后當(dāng)細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，采用平衡鹽溶液清洗，使用四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖，試劑購(gòu)自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：BJ-0251BT)，使用酶標(biāo)儀(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)MR-96A)在490 nm波長(zhǎng)處讀取A值，分析成骨細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.3.5 對(duì)硝基苯磷酸鹽法檢測(cè)成骨細(xì)胞中ALP的活性：細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.2。使用對(duì)硝基苯磷酸鹽法分析成骨細(xì)胞中ALP的活性，試劑購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司(批號(hào)：S46070-1g)使用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處讀取A值，分析成骨細(xì)胞ALP活性。

1.3.6 病理學(xué)觀察：每組大鼠處死后快速截取大鼠股骨骨組織，將其置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，制作常規(guī)石蠟切片，在濃度0.5%蘇木精-伊紅染色液中染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

1.3.7 骨代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：處死大鼠前抽取大鼠腹部靜脈血3 mL，以3 000 r/min離心10 min后，分離上層血清，用于骨代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。(1)骨鈣素水平。采用5 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進(jìn)行溶解，濃度為10～20 μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4℃過(guò)夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的150 μL牛血清蛋白(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)：LM-161)，在37℃環(huán)境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的牛血清，加入骨鈣素標(biāo)準(zhǔn)品(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：JL2019-48T)，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μL稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：9003-99-0)標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000；遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：YM-XQ0470P)，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，使用顯色劑顯色20 min，在酶標(biāo)儀上讀取405 nm波長(zhǎng)處的A值，測(cè)定骨鈣素水平。(2)鈣水平：嚴(yán)格按照偶氮胂Ⅲ試劑盒及其相關(guān)試劑[由北京森美?？爽斏锟萍加邢薰咎峁?，京藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第2400914號(hào)]說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。(3)磷水平：將2 mL靜脈血放入50 mL消化管中，加入混合酸15 mL，過(guò)夜。次日，將消化管放入消化爐中，消化開(kāi)始時(shí)可將溫度調(diào)低約130℃左右，然后逐步將溫度調(diào)高至240℃左右進(jìn)行消化，直至可見(jiàn)白煙、液體變成無(wú)色或黃綠色。取樣品及空白液各2 mL加入20 mL具塞試管中，然后依次加入2 mL鉬酸銨溶液、lmL亞硫酸鈉溶液、1 mL對(duì)苯二酚溶液，加蒸餾水定容至20 mL，混勻，靜置30 min，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定其A值，并根據(jù)測(cè)出的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上算得磷含量。(4)骨密度：采用雙能X線(xiàn)骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠股骨骨密度。

1.3.8 免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá)水平：干預(yù)3周后，將提取到的大鼠成骨細(xì)胞標(biāo)本，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行總蛋白定量分析，試劑購(gòu)自北京譜析科技有限公司(批號(hào)：B4509)。50 μg的蛋白樣品上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜，使用5%的脫脂奶粉TBST緩沖液(蘇州亞科科技股份有限公司，批號(hào)：H0013)進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(RANKL、RANK、OPG按照1 ∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中過(guò)夜保存；第2天使用TBST緩沖液洗滌后加入二抗稀釋溶液(按照1 ∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次使用TBST緩沖液洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光液(Biochannel公司，批號(hào)：BC-WB-004-100ml)，曝光2～3次，取平均值。使用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值，并計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。內(nèi)參蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；抗體購(gòu)自上海詩(shī)溪化工科技有限公司，批號(hào)JK40085)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠成骨細(xì)胞增殖指數(shù)和ALP活性比較 高劑量葛根素組、低劑量葛根素組、正常組、模型組成骨細(xì)胞增殖指數(shù)及ALP活性均依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1及圖1。

表1 4組大鼠成骨細(xì)胞增殖指數(shù)和ALP活性比較(x±s)

圖1 4組大鼠成骨細(xì)胞增殖指數(shù)(二甲基亞砜染色，×50)

2.2 4組大鼠股骨組織病理學(xué)變化 正常組大鼠骨組織細(xì)胞分布規(guī)則有序，細(xì)胞之間的間距??；模型組大鼠骨組織髓腔之間的間隙較大，細(xì)胞分布不規(guī)則且疏松；葛根素組大鼠骨組織細(xì)胞間隙減小，髓腔之間的間隙也逐漸縮小，其中高劑量葛根素組大鼠表現(xiàn)更加明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 4組大鼠股骨組織病理組織學(xué)變化(蘇木精-伊紅染色，×400)

2.3 4組大鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)比較 模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組、正常組骨密度以及血清骨鈣素水平均依次降低，模型組、低劑量葛根素組、正常組、高劑量葛根素組血清鈣和磷水平依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)比較(x±s)

2.4 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組、正常組RANKL、RANK蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低，而OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

表3 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

圖3 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白電泳圖

3 討 論

在骨代謝中，破骨細(xì)胞促進(jìn)骨吸收，成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成，當(dāng)骨吸收和骨形成相對(duì)平衡時(shí)，才能維持機(jī)體正常骨量[9]。隨著年齡的增加，胰島功能逐漸降低，患骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)性逐漸增高[1]。骨質(zhì)疏松有較高的致殘性，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。葛根素具有和雌激素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以起到雌激素的作用，預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的效果顯著，且毒副作用較小[10]。本研究中，病理組織學(xué)結(jié)果顯示，模型組大鼠骨組織髓腔之間的間隙較大，骨組織細(xì)胞分布不規(guī)則、疏松，說(shuō)明建模成功。ALP作為骨形成過(guò)程的主要參與酶之一，可反映成骨細(xì)胞的分化、成熟及活性，ALP活性隨著成骨細(xì)胞分化而逐漸增強(qiáng)，同時(shí)也反映了成骨細(xì)胞的活性[11-12]。同時(shí)，ALP是骨基質(zhì)形成的重要標(biāo)志物，可以反映骨形成，評(píng)估骨轉(zhuǎn)化的情況[13]。此外，陳明等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ALP通過(guò)分解磷酸酯中的無(wú)機(jī)磷，進(jìn)一步促進(jìn)基質(zhì)發(fā)生礦化。本研究結(jié)果顯示，低劑量及高劑量葛根素組大鼠成骨細(xì)胞的增殖指數(shù)和ALP均高于模型組及正常組(均P<0.05)，說(shuō)明葛根素能夠提高成骨細(xì)胞活性；而且高劑量葛根素組大鼠成骨細(xì)胞的增殖指數(shù)和ALP均高于低劑量葛根素組(均P<0.05)，說(shuō)明高劑量(75 mg/kg)的葛根素可更顯著地增加ALP活性，對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更明顯。研究表明，骨代謝標(biāo)志物水平增高時(shí)，提示高骨轉(zhuǎn)換以及骨丟失加快[15]。血清鈣、磷水平是骨代謝主要的骨礦成分，兩者的含量穩(wěn)定是骨吸收和骨形成平衡的重要標(biāo)志[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中骨密度、骨鈣素、鈣、磷水平均高于其他3組(均P<0.05)，說(shuō)明骨質(zhì)疏松會(huì)導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換和骨丟失加快；而模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組骨密度、骨鈣素、鈣、磷水平依次降低(均P<0.05)，說(shuō)明葛根素能夠降低大鼠骨密度以及血清骨鈣素、鈣、磷含量，維持骨吸收和骨形成的平衡，且高劑量(75 mg/kg)的葛根素作用更為顯著。

RANKL/RANK/OPG相關(guān)通路是骨吸收和骨形成過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)通路，其中OPG蛋白是唯一與成骨細(xì)胞膜上RANKL相結(jié)合的受體，主要作用是在RANKL和RANK結(jié)合的過(guò)程中起到抑制作用，從而阻斷破骨細(xì)胞前體發(fā)生分化和融合，對(duì)成熟的破骨細(xì)胞有明顯的抑制作用，從而對(duì)破骨細(xì)胞的凋亡起到一定的抑制作用[16-17]。研究表明，成骨細(xì)胞受到骨吸收的刺激后會(huì)促進(jìn)RANKL分泌，而RANKL可以與破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，激活核因子κB通路，從而促進(jìn)成熟的破骨細(xì)胞分化形成[18-19]。成骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨相關(guān)因子的刺激，會(huì)促進(jìn)OPG分泌，與RANKL競(jìng)爭(zhēng)與RANK受體結(jié)合，對(duì)破骨細(xì)胞的形成以及活性起到一定的抑制作用[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組、低劑量、高劑量葛根素組大鼠的RANKL、RANK相對(duì)表達(dá)量依次降低，而OPG相對(duì)表達(dá)量依次升高(均P<0.05)，提示葛根素可能通過(guò)調(diào)控RANKL/RANK/OPG相關(guān)通路，從而發(fā)揮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。

綜上所述，葛根素可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖，提高成骨細(xì)胞活性，維持骨吸收和骨形成的平衡，其機(jī)制可能與調(diào)控RANKL/RANK/OPG相關(guān)通路蛋白的表達(dá)有關(guān)。