miR-16 在冠心病患者血清中表達(dá)及功能分析

靳 星，李文祎，馬 蓉

(1.隆堯縣醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺(tái) 055350；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100044)

微小RNA(microRNA, miR)是屬于小分子非編碼RNA的一種，它們可以通過(guò)與靶基因的3'UTR結(jié)合抑制其表達(dá)。近來(lái)研究表明，miR的表達(dá)變化與多種疾病相關(guān)。在冠心病中，也存在多種上調(diào)或下調(diào)性變化的miR，它們共同參與該病的調(diào)控過(guò)程。miR-16是一種廣泛表達(dá)的miR，血漿中也可檢測(cè)到該miR的表達(dá)。研究證實(shí)，miR-16的表達(dá)在多種疾病，如腫瘤、心肌肥厚、腦中風(fēng)等[1-3]。在心肌肥厚過(guò)程中，miR-16的表達(dá)下調(diào)，并因此促進(jìn)靶基因細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1、D2、E1表達(dá)的上調(diào)，加重心肌肥厚[3]。然而，miR-16在血管平滑肌中的作用尚不清楚，本研究分別通過(guò)檢測(cè)冠心病患者血漿miR-16的表達(dá)變化，探討該miR與冠心病的關(guān)系，并通過(guò)研究該miR對(duì)血管平滑肌增殖的影響初步探討該miR的作用機(jī)制，旨在為冠心病的診斷、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 隨機(jī)選取在2016年9月至2017年10月于隆堯縣醫(yī)院心內(nèi)科住院并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心病患者43例，男30例，女13例，年齡(65.8±11.3)歲；對(duì)照組為同期經(jīng)心電圖、超聲心動(dòng)圖等檢測(cè)排除心臟疾病，來(lái)我院體檢的健康人49例，，男23例，女26例，年齡(60.4±12.8)歲。

1.2樣品采集 各組研究對(duì)象均抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，并收集于EDTA-K2抗凝管中。采血后，迅速在4 ℃下以3 000 r/min離心，收集上層血漿，分裝于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血漿miR提取及檢測(cè) 采用mirVana血漿miR提取試劑盒，按照使用說(shuō)明加入線蟲Cel-miR-39類似物作為內(nèi)參，依據(jù)試劑盒的使用說(shuō)明提取血漿總RNA。用NanoDrop檢測(cè)RNA濃度，經(jīng)過(guò)稀釋、濃度矯正后采用ABI公司microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣品中miR-16和Cel-miR-39進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各樣品中miR-16及Cel-miR-39的Ct值，以miR-16與Cel-miR-39的相對(duì)Ct值表示miR-16在各樣品中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。按對(duì)照組miR-16的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，觀察各組相對(duì)于對(duì)照組血漿miR-16的表達(dá)變化。

1.4細(xì)胞處理與活力檢測(cè) 將人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞傳代、細(xì)胞計(jì)數(shù)，并稀釋至100 000個(gè)細(xì)胞/ml的密度，迅速接種于96孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞培養(yǎng)液血清濃度降至0.1%，以同步化細(xì)胞周期。血清饑餓24 h后采用Lipofectamin 3000試劑分別將miR-16類似物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h在相應(yīng)的細(xì)胞中加入PDGF-BB(終濃度10 nmol/L)處理。轉(zhuǎn)染后48 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并在每個(gè)孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將96孔板再次放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出觀察細(xì)胞懸液顏色變化，放置于酶標(biāo)儀上并檢測(cè)450 nm處吸光度數(shù)值。各組的吸光度數(shù)值經(jīng)過(guò)歸一化處理后分析其變化情況，并以此表示各組細(xì)胞的細(xì)胞活力變化。

1.5靶基因檢測(cè) 將人臍靜脈平滑肌細(xì)胞接種于12孔板，采用Lipofectamin 3000試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后收集各組細(xì)胞，并采用Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中cyclin D1、cyclin D2和cyclin E1的表達(dá)強(qiáng)度。具體步驟如下：將各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，低溫靜置、震蕩，充分裂解，并在4 ℃條件下以12 000 r/min進(jìn)行離心。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。定量后，采用RIPA裂解液稀釋至2 μg/μl的工作液，加入5X上樣緩沖液之后，在100 ℃中加熱煮沸5 min。之后，迅速置于冰上降溫，短暫離心后將各組樣品加入到SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳分離(濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 60 min)。之后，將膠取出，置于電轉(zhuǎn)儀上進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)膜(300 mA, 120 min)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出NC膜，采用麗春紅工作液染色，并采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，采用含有抗cyclinD1、cyclin D2、cyclin E1及GAPDH的一抗稀釋液(1∶1 000)于4 ℃搖床上緩慢孵育過(guò)夜。次日，采用TBST溶液漂洗4次，并用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。采用TBST溶液再次漂洗4次后加入化學(xué)發(fā)光底物顯色。通過(guò)Quantity One軟件拍攝、記錄圖像并掃描各條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以上述蛋白與GAPDH灰度的比值計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1冠心病患者血漿miR-16水平下調(diào) 為探討miR-16在冠心病患者中的變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血漿標(biāo)本中該miR的變化。血漿miR-16的表達(dá)在冠心病患者中顯著下調(diào)(1.00±0.42 vs 0.75±0.23，P<0.05)，表明miR-16表達(dá)的下調(diào)可能與冠心病有關(guān), 見(jiàn)圖1。

圖1 血漿 miR-16 的表達(dá)強(qiáng)度 *與對(duì)照組比較P<0.05

2.2miR-16 對(duì)血管平滑肌增殖的調(diào)控作用 為探討 miR-16 對(duì)血管平滑肌增殖的作用，采用 CCK-8 法檢測(cè)過(guò)表達(dá) miR-16 后血管平滑肌細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染 miR-16 類似物48 h后，血管平滑肌細(xì)胞的增殖活力顯著下降，是對(duì)照組的23.1%，見(jiàn)圖 2。在此基礎(chǔ)上采用血小板源生生長(zhǎng)因子 PDGF-BB(50 ng/L)刺激血管平滑肌增殖，觀察到過(guò)表達(dá) miR-16 類似物的血管平滑肌細(xì)胞增殖活力 是陰性對(duì)照組的53.8%，表明過(guò)表達(dá) miR-16 后可部分對(duì)抗 PDGF-BB 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，見(jiàn) 圖 2。采用Western印跡對(duì)其靶基因cyclin D1、D2及E1進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-16后可顯著降低上述基因的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖2 miR-16 對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響 采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力

圖3 miR-16 對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 采用蛋白印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-16后血管平滑肌細(xì)胞中cyclin D1、D2及E1表達(dá)的變化(a)。進(jìn)行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(b)。**與對(duì)照組比較P<0.01

3 討 論

miR是一種細(xì)胞內(nèi)的小分子非編碼RNA，其長(zhǎng)度大約為21～23 nt。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR參與了胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，如細(xì)胞周期及增殖、凋亡、自噬等[4-8]。初始的miR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物較長(zhǎng)，經(jīng)胞內(nèi)酶切處理后形成成熟體的miR。這些miR可與其靶基因的3'UTR結(jié)合進(jìn)而影響后者的表達(dá)。目前研究證實(shí)，miR主要發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的功能，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，3'UTR結(jié)合miR后主要通過(guò)抑制該靶基因的翻譯而影響其表達(dá)。miR是一種小分子調(diào)控分子，因此其可以較容易的從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外以及循環(huán)血中。相較于大多數(shù)RNA分子，miR由于分子量較小而具有較高的穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)移至循環(huán)血中時(shí)可以在較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在。因此，循環(huán)血中的miR就有可能被遠(yuǎn)隔部位的細(xì)胞重新攝取，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。基于該特性，循環(huán)血miR的檢測(cè)為疾病的診斷以及疾病發(fā)病的分子機(jī)制研究提供了新方法[9]。

目前研究表明，多種疾病如心血管疾病、腫瘤等，其患者循環(huán)血中特定類型的miR表達(dá)均可呈現(xiàn)顯著變化[10-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血漿miR-16表達(dá)水平呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，由此提示該miR很可能在冠心病發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。

miR-16是一種調(diào)控細(xì)胞周期的小分子非編碼RNA，其高表達(dá)可顯著抑制多種cyclins的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[1, 17-20]。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，miR-16可負(fù)向調(diào)控cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達(dá)[3]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-16可顯著抑制該細(xì)胞增殖，并顯著下調(diào)cyclin D1、D2及cyclin E1的表達(dá)強(qiáng)度。血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖是冠狀動(dòng)脈狹窄的病理機(jī)制之一。當(dāng)血管內(nèi)皮受到氧化應(yīng)激、炎癥損傷時(shí)，其功能紊亂，同時(shí)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，即由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛?。分泌型的血管平滑肌?xì)胞逐漸失去其原有的形態(tài)和功能，獲得細(xì)胞增殖、遷移、合成分泌的能力。發(fā)生表型轉(zhuǎn)換后的血管平滑肌細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力增加，進(jìn)而加重血管的重塑和管腔狹窄。在本研究中，我們不僅發(fā)現(xiàn)在冠心病患者循環(huán)血中miR-16出現(xiàn)顯著降低，還發(fā)現(xiàn)該miR過(guò)表達(dá)后抑制了血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin D2及cyclin E1的表達(dá)下調(diào)。由此提示，該miR很可能發(fā)揮了抑制冠心病的作用。通過(guò)分子生物學(xué)手段阻斷血管平滑肌細(xì)胞的增殖很可能是治療冠心病的有效策略。我們的研究表明， 過(guò)表達(dá)miR-16 后可顯著阻斷血管平滑肌細(xì)胞增殖，該過(guò)程很可能是通過(guò)靶向抑制細(xì)胞周期蛋白 cyclin D1、cyclin D2 及 cyclin E1所致。然而，本研究還存在一些局限性：首先，本研究中病例數(shù)目較少，需要在更大規(guī)模的人群中做相關(guān)分析；其次，本研究尚未在動(dòng)物模型上做相關(guān)驗(yàn)證，尚不能完全闡明miR-16對(duì)冠心病發(fā)展以及血管平滑肌細(xì)胞增殖的直接關(guān)系。因此，關(guān)于miR-16與冠心病之間的分子機(jī)制仍是今后研究的重點(diǎn)。

綜上所述，miR-16 是一種冠心病及血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān) miR-16，其表達(dá)在冠心病患者中下調(diào)。該 miR可通過(guò)抑制多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，miR-16 很可能是冠心病防治的潛在靶點(diǎn)。