槲皮素對大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用及ERK1/2-MAPK信號通路的影響

王 鵬，夏曉楓，左 斌，何精選，羅 斌，鄒 凱

缺乏機(jī)械負(fù)荷或機(jī)體運(yùn)動障礙可能會造成骨骼結(jié)構(gòu)和完整性的變化，導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)流失廢用性骨質(zhì)疏松癥[1-2]。宇航員在太空飛行期間1個月骨質(zhì)丟失達(dá)到總骨量的2%，相當(dāng)于絕經(jīng)1年以上女性的骨質(zhì)流失。既往文獻(xiàn)報(bào)道，由于下肢軸承重量的消除，多達(dá)10%的骨量可能會丟失[3-4]。廢用性骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的主要病理變化是骨孔增加和強(qiáng)度降低，導(dǎo)致骨折，引起機(jī)體功能惡化和病死率增加。越來越多的證據(jù)表明，骨形成的減少是廢用性骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的主要指標(biāo)之一[5]。槲皮素是從蘆丁(蕓香甙)、槲皮甙、金絲桃甙中提取的主要生物活性黃酮類化合物，具有免受絕經(jīng)后、糖皮質(zhì)激素、維A酸、睪丸切除術(shù)和衰老引起骨質(zhì)疏松癥的有益作用[6]。槲皮素體外實(shí)驗(yàn)已被證明可有效增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加成骨標(biāo)志物如骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、骨保護(hù)素(OPG)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達(dá)[7]。同時，槲皮素可以通過阻止核因子-κB(NF-κB)受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)的NF-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號級聯(lián)激活以及破骨細(xì)胞基因標(biāo)記的表達(dá)來消除破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞分化[8]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在成骨調(diào)節(jié)中起重要作用[9]。本研究探討了槲皮素對大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用及對ERK1/2-MAPK信號通路的影響，旨在為廢用性骨質(zhì)疏松癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 槲皮素(原料藥，純度95%，西安綠天生物技術(shù)有限公司，批號Q19057)；強(qiáng)骨膠囊(北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格0.25 g/粒，批號190817)；安息香酊、水合氯醛、化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號C0946、C17496、P0018S)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號LK-00697)；ReverTra Ace qPCR R反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix試劑盒(上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司，批號FSQ-101、QPK201)；放射免疫沉淀緩沖液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號YM-S2014)；Nuclear Extract Kit試劑盒(上海艾躍生物科技有限公司，批號40010)；BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號PA1197)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膜(賽默飛世爾科技中國有限公司，批號SY55491)；ERK1/2、MAPK、β-actin一抗、辣根過氧化物酶綴合的二抗(安諾倫北京生物科技有限公司，批號P0655、P0742、PQ10339、SF-13556)；DXA-09型雙能X線發(fā)射儀、ImageQuant LAS 4000型化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國GE Healthcare公司)；西門子顯微CT機(jī)(德國西門子公司)；CFX384Touch型實(shí)時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取清潔級SD大鼠80只，10～12周齡，體重230～270 g；湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0003，動物使用許可證號：SYXK(湘)2019-0012，動物質(zhì)量合格證號：2019L00173。隨機(jī)分為對照組、模型組、強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組，每組16只，自由攝取飼料、飲水，自動控制晝夜循環(huán)(12/12 h)，室溫(22±1)℃。

1.3動物建模及給藥 模型組、強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組建立大鼠廢用性骨質(zhì)疏松模型：用70%異丙醇清潔大鼠尾部并涂上安息香酊連接到線束裝置上，線束裝置的另一端連接到籠子頂部的旋轉(zhuǎn)裝置，使大鼠的頭部向下傾斜30°夾角，防止大鼠的后肢在實(shí)驗(yàn)期間的任何時間接觸地面，持續(xù)4周[12]。對照組無任何處理。從造模第1天開始，強(qiáng)骨膠囊組給予強(qiáng)骨膠囊250 mg/kg[10]灌胃，槲皮素低、高劑量組給予槲皮素100、200 mg/kg[11]灌胃，灌胃體積為10 ml/kg，1/d；對照組及模型組給予等體積生理鹽水，1/d；5組均給藥4周。

1.4股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分散度測定 在大鼠處死前1天，腹膜內(nèi)注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并在標(biāo)本平臺上仰臥，使兩后肢分別取彎曲和伸展姿勢。通過雙能X線吸收測定法測量體內(nèi)股骨遠(yuǎn)端的骨密度。將大鼠股骨置于70%乙醇中，顯微CT機(jī)掃描股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨，能量設(shè)置為500 mA和80 kV，分析骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

1.5股骨ERK1/2、MAPK mRNA水平測定 切下大鼠股骨，以液氮搗碎，并使用Trizol試劑從收獲的股骨渣中提取總RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒將反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由碧云天生物技術(shù)研究所合成。引物序列如下：ERK1/2正向：5'-AGCCTTCGTTGCTGTGGAGA-3'，反向5'-TGGTGTCATAAGGATGGTGG-3'；MAPK正向 5'-AGGGTCCTACACATACTTCG-3'，反向5'-GGTCCTTGGTTAGCATTCTC-3'；β-actin正向 5'-CAAACTGCTAAATGACGAGG-3'，反向5'-GGGAAAGGTTGTGTAGGGTC-3'。使用SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件是94℃ 30 s，然后95℃，5 s和60℃，30 s；30個循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算ERK1/2、MAPK mRNA的相對表達(dá)水平，其中β-actin是內(nèi)參基因。

1.6股骨ERK1/2、MAPK蛋白水平測定 將大鼠股骨在液氮中研磨，放射免疫沉淀緩沖液裂解蛋白質(zhì)，使用Nuclear Extract Kit試劑盒提取核蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定分離的蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE電泳分離100 mg蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；在5%脫脂乳中封閉后，將膜與ERK1/2(1∶1000)、MAPK(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗孵育，在4℃過夜。然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5000)孵育2 h。增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白印跡，使用ImageQuant LAS 4000型化學(xué)發(fā)光成像分析儀成像。

2 結(jié)果

2.1股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比較 與對照組比較，模型組股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度顯著降低，骨小梁分散度顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高量組股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度顯著升高，骨小梁分散度顯著降低(P<0.05)。與槲皮素低劑量組比較，強(qiáng)骨膠囊組和槲皮素高劑量組骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度升高，骨小梁分散度降低(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強(qiáng)骨膠囊組股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的比較

2.2股骨骨小梁結(jié)構(gòu)及數(shù)量比較 對照組股骨骨小梁結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量較多，且相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；模型組股骨骨小梁結(jié)構(gòu)疏松、數(shù)量較對照組明顯減少，且各骨小梁互相獨(dú)立、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少；槲皮素低劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組變化不明顯；強(qiáng)骨膠囊組及槲皮素高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組密集，數(shù)量增加，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也增加。見圖1。

2.3股骨ERK1/2、MAPK mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達(dá)水平顯著降低，且槲皮素高劑量組與強(qiáng)骨膠囊組低于槲皮素低劑量組(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強(qiáng)骨膠囊組股骨ERK1/2 mRNA、MAPK mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠股骨ERK1/2 mRNA和MAPK mRNA表達(dá)水平比較

2.4股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達(dá)水平降低，且槲皮素高劑量組和強(qiáng)骨膠囊組低于槲皮素低劑量組(P<0.05)。槲皮素高劑量組與強(qiáng)骨膠囊組股骨ERK1/2、MAPK 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 5組大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白印跡圖

表3 5組大鼠股骨ERK1/2、MAPK蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

骨是通過有機(jī)基質(zhì)礦化連續(xù)形成的更新組織。成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收平衡被破壞會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等骨病。廢用性骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨質(zhì)疏松疾病。槲皮素在自然界中廣泛存在，是一種具有許多藥理活性的類黃酮；可消除自由基，抗病毒及保護(hù)心血管；還可預(yù)防過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能障礙[13]。槲皮素是一種黃酮類化合物，可有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化[14]，可抑制RAW264.7細(xì)胞中的破骨細(xì)胞生成。在動物骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)中，將大鼠切除卵巢60 d并給予不同劑量的槲皮素，結(jié)果表明槲皮素可以改善大鼠骨密度，逆轉(zhuǎn)海綿骨的微觀結(jié)構(gòu)，提高生物力學(xué)性能；同時，槲皮素可以上調(diào)其成骨細(xì)胞并下調(diào)破骨細(xì)胞的能力[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組股骨骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度明顯升高，骨小梁分散度明顯降低；且槲皮素高劑量組和強(qiáng)骨膠囊組骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度高于槲皮素低劑量組，骨小梁分散度低于槲皮素低劑量組。模型組股骨骨小梁結(jié)構(gòu)疏松、數(shù)量較對照組明顯減少，且各骨小梁互相獨(dú)立、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少；強(qiáng)骨膠囊組及槲皮素高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組密集，數(shù)量增加，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也增加。這說明槲皮素能顯著改善骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)量，增加骨密度，預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松。

MAPK蛋白通過與受體復(fù)合物(Frizzled和LRP5/6)結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)復(fù)合物失活、β-連環(huán)蛋白降解。β-連環(huán)蛋白可以在細(xì)胞質(zhì)中積累，然后易位到細(xì)胞核中，從而促進(jìn)骨骼中特定基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化減少并促進(jìn)破骨細(xì)胞生成[16-17]。ERK1/2是骨和骨髓中最豐富的p38成員，并且在生理性骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。選擇性ERK1/2抑制劑可預(yù)防雌激素戒斷導(dǎo)致的骨質(zhì)消耗[18]。有研究報(bào)道，與野生型同窩小鼠相比，由于機(jī)械刺激引起的骨形成增加在ERK1/2-MAPK信號激活的突變小鼠中消失，導(dǎo)致骨量減少；并且通過尾部懸浮機(jī)械卸載，降低了ERK1/2-MAPK蛋白信號傳導(dǎo)的活性[19]。槲皮素抑制ERK1/2-MAPK信號傳導(dǎo)對去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松有明顯改善作用[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組股骨ERK1/2 mRNA和蛋白表達(dá)水平、MAPK mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組，且強(qiáng)骨膠囊組、槲皮素低、高劑量組低于模型組，且槲皮素高劑量組和強(qiáng)骨膠囊組低于槲皮素低劑量組。這與上述討論一致，提示槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制ERK1/2-MAPK信號通路的傳導(dǎo)。

綜上所述，槲皮素能顯著改善骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)量，增加骨密度，可預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松；其機(jī)制與槲皮素可抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制ERK1/2-MAPK信號通路的傳導(dǎo)有關(guān)。