不同刺激方式對(duì)在體和離體蛙腓腸肌單收縮影響的定量分析*

許培宏, 唐 鳳, 王雪薇，王 歡, 李少壘, 沈建新, 江 玲, 陳 穗, 王海燕

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，4.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

觀測(cè)不同強(qiáng)度電刺激對(duì)蛙腓腸肌收縮的影響是生理學(xué)和機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)典項(xiàng)目，有的采用離體標(biāo)本(invitrospecimen)，有的采用在體標(biāo)本(invivospecimen)，但一般都使用間接刺激(indirect stimuli，即通過刺激支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)引起肌肉的收縮)[1, 2]。在體標(biāo)本和離體標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)效果是否有不同？如將間接刺激改為直接刺激(direct stimuli，即刺激信號(hào)直接作用于肌肉)，效果是否一樣？目前尚無對(duì)此兩個(gè)問題的定量研究。本工作分別制備在體和離體蛙腓腸肌標(biāo)本,并分別施以間接電刺激(通過坐骨神經(jīng)施加刺激)或直接電刺激(刺激電極用細(xì)針灸針,直接刺入腓腸肌中施加刺激)，用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420F)實(shí)時(shí)記錄不同強(qiáng)度刺激對(duì)肌肉收縮的影響；后續(xù)通過自編程輔助處理分析肌肉收縮數(shù)據(jù)，對(duì)單收縮特征參數(shù)進(jìn)行定量比較分析，以便對(duì)上述兩個(gè)問題作出明確回答。本工作實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究時(shí)標(biāo)本和刺激方式的選取將有重要的指導(dǎo)意義。此外，給予萎縮肌肉和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維電刺激的方法已經(jīng)普遍應(yīng)用于臨床康復(fù)醫(yī)學(xué)，研究相關(guān)刺激參數(shù)對(duì)骨骼肌收縮特性的影響對(duì)于臨床指導(dǎo)肌萎縮或神經(jīng)運(yùn)動(dòng)纖維損傷康復(fù)將可提供有益的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[3-6].

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牛蛙，雌雄不拘，健康有活力，體重約100 g；共40只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

常用蛙類手術(shù)器械、任氏液點(diǎn)滴裝置(自制)、張力換能器、鐵支架、三通管、直接刺激電針(自制)、生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)BL-420F(含硬件、軟件和配件，均購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司)、標(biāo)準(zhǔn)任氏液等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)任氏液的配制

按照標(biāo)準(zhǔn)任氏液的配方配制標(biāo)準(zhǔn)任氏液。溶液的配制遵照標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程，采用雙蒸水配制，當(dāng)天配制當(dāng)天使用[1,2,7]。

1.4 實(shí)驗(yàn)裝置連接

間接刺激裝置連接(圖1A)：刺激輸出(stimulus output)通過保護(hù)電極作用于在體標(biāo)本(或離體標(biāo)本)的坐骨神經(jīng)；直接刺激裝置連接(圖1B): 刺激輸出通過細(xì)針灸針刺入腓腸肌，直接給腓腸肌電刺激。張力換能器與BL-420F系統(tǒng)的通道1連接。(圖1A、B)

Fig. 1 Diagram of experimental device

1.5 實(shí)驗(yàn)方案

分四個(gè)組：(1)間接刺激在體標(biāo)本組，簡(jiǎn)稱在體間接組(vivo-ind，n=12)；(2)直接刺激在體標(biāo)本組，簡(jiǎn)稱在體直接組(vivo-dir，n=8)；(3)間接刺激離體標(biāo)本組，簡(jiǎn)稱離體間接組(vitro-ind，n=12)；(4)直接刺激離體標(biāo)本組，簡(jiǎn)稱離體直接組(vitro-dir，n=8)。

按常規(guī)方法分別制備蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌在體和離體標(biāo)本[1,2]，之后分別對(duì)標(biāo)本施加間接刺激或直接刺激，通過BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的第1通道(channel 1)記錄由刺激引起的腓腸肌收縮張力信號(hào)。間接刺激由保護(hù)電極作用于支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)從而引起腓腸肌收縮，而直接刺激由兩根細(xì)針灸針組成的刺激電極直接刺入腓腸肌中施加刺激。這兩種刺激電極分別連接到BL-420F實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)刺激輸出端口; 刺激輸出參數(shù)設(shè)置如下[1, 2, 8]：程控單刺激，波寬0.05 ms，延時(shí)100 ms，采樣率1 KHz，強(qiáng)度從0 V開始，周期3 s，增量0.02 V，最大刺激不超過3 V。實(shí)驗(yàn)過程中通過自制裝置勻速滴加任氏液以保持標(biāo)本活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用上述方案，用BL-420F所記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量較多，后續(xù)可導(dǎo)出數(shù)據(jù)到TXT文件中，再用第三方軟件(本工作用EXCEL VBA)編程輔助對(duì)TXT文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行批量計(jì)算，從而較快速準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)的定量處理分析，由此可獲得肌肉收縮幅度-刺激強(qiáng)度關(guān)系曲線并得到各組數(shù)據(jù)的閾強(qiáng)度、半高強(qiáng)度和最適強(qiáng)度以及最大單收縮幅度、收縮期、上升斜率等重要參數(shù)。其中，腓腸肌的收縮幅度從無到有所對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度，即使肌肉產(chǎn)生可測(cè)量收縮幅度的最小刺激強(qiáng)度，稱為閾強(qiáng)度；當(dāng)肌肉的收縮幅度不再隨著刺激強(qiáng)度的增大而增大時(shí)，對(duì)應(yīng)的臨界刺激強(qiáng)度，即使肌肉收縮達(dá)到最大幅度的最小刺激，稱為最適刺激強(qiáng)度[1,2]；而當(dāng)肌肉收縮達(dá)到最大收縮幅度的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度，稱為半高刺激強(qiáng)度。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)視需要采用方差分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 間接刺激對(duì)在體腓腸肌標(biāo)本的單收縮影響

采用前述方法，對(duì)在體蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本施以間接刺激(屬vivo-ind組)，由此可獲得肌肉收縮幅度-刺激強(qiáng)度關(guān)系曲線(圖2A)。分析此幅度-強(qiáng)度關(guān)系曲線可知：隨著強(qiáng)度不斷增大，腓腸肌的收縮幅度從無到有，從小到大，增大到一定程度后不再隨著刺激強(qiáng)度的增大而增大，保持幅度基本穩(wěn)定不變，呈一個(gè)長(zhǎng)尾S型曲線。在本例中，閾強(qiáng)度為 0.38 V(圖2A，2B中的①)；半高刺激強(qiáng)度為0.42 V(圖2A，2B中的②)；最適刺激強(qiáng)度為1.44 V(圖2A，2B中的③)。選取腓腸肌的收縮幅度達(dá)到最大的波形(如圖2B中的④)進(jìn)行精細(xì)測(cè)量，可得到腓腸肌單收縮的收縮期、舒張期、收縮上升斜率等重要參數(shù)(圖2C)。

2.2 間接刺激和直接刺激對(duì)在體腓腸肌標(biāo)本單收縮特性的影響

為探究在體標(biāo)本中，間接刺激與直接刺激對(duì)肌肉收縮性能有何不同影響，我們采用與2.1所述相同的刺激設(shè)置方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌在間接刺激下(屬vivo-ind)產(chǎn)生單收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度均小于在直接刺激下(屬vivo-dir)產(chǎn)生單收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度(P<0.05)。(2)在體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期均大于在直接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期(P<0.05)；最大單收縮半高寬和舒張期則無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率小于在直接刺激下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值則無明顯差異(表1, 圖3)。

Fig. 2 Typical results and analysis(take one with indirect stimuli in vivo as an example)

Tab. 1 Comparison of vivo-ind and vivo-dir group )

2.3 間接刺激和直接刺激對(duì)離體腓腸肌標(biāo)本單收縮特性的影響

為探究離體標(biāo)本中，間接刺激與直接刺激對(duì)肌肉收縮性能有何不同影響，我們采用與2.1所述相同的刺激設(shè)置方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)離體蛙腓腸肌在間接刺激下(屬vitro-ind)產(chǎn)生單收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度均小于在直接刺激下(屬vitro-dir)產(chǎn)生單收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度(P<0.05)。(2)離體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期均大于在直接刺激作用下產(chǎn)生的最大單收縮幅度和收縮期(P<0.05)；最大單收縮半高寬和舒張期則無明顯差異。(3)離體蛙腓腸肌在間接刺激作用下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率小于在直接刺激下產(chǎn)生最大單收縮的上升斜率(P<0.05)；但下降斜率、上升斜率/下降斜率的比值則無明顯差異。(表2, 圖4)

Fig. 3 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo

Tab. 2 Comparison of vitro-ind and vitro-dir group

Fig. 4 The effects of indirect and direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vitro

2.4 間接刺激對(duì)在體和離體腓腸肌標(biāo)本單收縮特性的影響

為探究間接刺激下，在體標(biāo)本與離體標(biāo)本的肌肉收縮性能有何不同，我們比較分析了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度均無明顯差異。(2)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮幅度、半高寬、舒張期和收縮期也均無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在間接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均無明顯差異(表3, 圖5)。

Tab. 3 Comparison of ind-vivo and ind-vitro group n=12)

Fig. 5 The effects of indirect stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

2.5 直接刺激對(duì)在體和離體腓腸肌標(biāo)本單收縮特性的影響結(jié)果比較

為探究直接刺激下，在體標(biāo)本與離體標(biāo)本的肌肉收縮性能有何不同，我們比較分析了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：(1)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生收縮的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度均無明顯差異。(2)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮幅度、半高寬、舒張期和收縮期也均無明顯差異。(3)在體蛙腓腸肌和離體蛙腓腸肌在直接刺激下產(chǎn)生的最大單收縮的上升斜率、下降斜率和上升斜率/下降斜率的比值也均無明顯差異(表4, 圖6)。

Tab. 4 Comparison of vivo-dir and vitro-dir group n=8)

Fig. 6 The effects of direct stimuli on the averaged wave pattern of twitch in vivo and in vitro

3 討論

如前所述，本研究的目的旨在通過定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析探討如下兩個(gè)問題：(1)不同強(qiáng)度刺激對(duì)在體和離體蛙腓腸肌單收縮實(shí)驗(yàn)的效果是否有不同影響？(2)如將常用的間接刺激(即通過刺激坐骨神經(jīng)引起腓腸肌收縮)改為直接刺激(即刺激信號(hào)直接作用于肌肉)，效果有無不同？

為達(dá)到此目的，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)方法上作了一定的創(chuàng)新：(1)任氏液滴加裝置：由于同一標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為保證標(biāo)本的活性，我們通過反復(fù)實(shí)踐自制了一套任氏液點(diǎn)滴裝置：利用常規(guī)輸液管，加裝一個(gè)三通管，同時(shí)同步以固定頻率和固定流量給肌肉和神經(jīng)持續(xù)滴加任氏液。此裝置可避免實(shí)驗(yàn)過程中不必要的人為介入，肌肉的活性良好，提高了實(shí)驗(yàn)成功率。(2)直接刺激電針：文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于直接刺激牛蛙腓腸肌引起肌肉收縮方法的報(bào)道。臨床上，有采用體表電極刺激肌肉的運(yùn)用[9]，但由于牛蛙腓腸肌體積小，接觸面小，體表與人體不同，不適合使用體表電極。最終，我們借鑒有關(guān)直接刺激家兔眼輪匝肌重建肌肉性能的實(shí)驗(yàn)[10]，設(shè)計(jì)研究出一套適用于牛蛙腓腸肌的直接刺激裝置：將兩枚直徑0.35 mm針灸針分別與裸露的細(xì)軟銅電線焊在一起，用電工膠布將兩枚針灸粗端針近端包裹隔離避免短路；針灸針暴露的遠(yuǎn)端平行插入肌肉后就形成了電流回路，直接刺激肌肉，實(shí)驗(yàn)證明效果良好。(3)刺激輸出和數(shù)據(jù)記錄及處理分析方面，我們將由生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420F)記錄得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出為文txt文件，之后再用EXCEL VBA編程輔助對(duì)txt數(shù)據(jù)文件進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范自動(dòng)化的處理分析。這樣可更高效地得到肌肉收縮相關(guān)的閾強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度及肌肉單收縮曲線，且結(jié)果更精準(zhǔn)，有利于定量比較分析。

通過統(tǒng)一規(guī)范的數(shù)據(jù)定量處理和分析比較，我們發(fā)現(xiàn)：(1)對(duì)在體標(biāo)本，與直接刺激比較：間接刺激的閾強(qiáng)度、半高強(qiáng)度和最適強(qiáng)度均更小(P< 0.05)；最大單收縮幅度更大，收縮期更長(zhǎng)，上升斜率更小(P<0.05)(對(duì)在體標(biāo)本施加間接刺激的例數(shù)為12，施加直接刺激的例數(shù)為8)。(2)對(duì)離體標(biāo)本，與直接刺激比較：間接刺激的閾強(qiáng)度、半高強(qiáng)度和最適強(qiáng)度也均更小(P<0.05)；最大單收縮幅度更大，收縮期更長(zhǎng)，上升斜率更小(P<0.05)(n離體間接=8,n離體直接=8)。(3)均采用間接刺激或直接刺激時(shí)，與離體標(biāo)本比較，在體標(biāo)本單收縮的各項(xiàng)參數(shù)均無差異(P>0.05)。

上述這些結(jié)果表明，雖然間接刺激和直接刺激都可以引起肌肉收縮，但通過刺激神經(jīng)間接引起肌肉收縮的效率更高(閾強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度更小，而最大單收縮幅度更大)，可能是因?yàn)殚g接刺激通過神經(jīng)纖維末梢、以運(yùn)動(dòng)單位[11,12]的形式可更方便地動(dòng)員更多的肌肉纖維參與收縮，因而更敏感，收縮力也更大。在本研究(性實(shí)驗(yàn))中，只要刺激方式相同(都是間接刺激或都是直接刺激)，在體標(biāo)本和離體標(biāo)本對(duì)骨骼肌收縮的相關(guān)特性指標(biāo)無明顯差異；但從標(biāo)本制備和實(shí)驗(yàn)的實(shí)施方便性方面考慮，在體標(biāo)本更易制備，更方便較長(zhǎng)時(shí)間保持其活性，更有實(shí)用優(yōu)勢(shì)；而如果要進(jìn)行給藥沖洗實(shí)驗(yàn)，則離體標(biāo)本更有優(yōu)勢(shì)。后續(xù)在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，可考慮延長(zhǎng)標(biāo)本的使用時(shí)間并檢測(cè)其活性，以獲得關(guān)于在體標(biāo)本和離體標(biāo)本在肌肉收縮性能方面有何不同的更確切的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果對(duì)于相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究時(shí)骨骼肌標(biāo)本(在體或離體)和刺激方式(間接或直接)的選取有重要的指導(dǎo)意義，而如能在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中如本文一樣引入定量比較分析的方法則可使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可信。