黃芪注射液對(duì)缺血性心肌病大鼠心肌自噬及心肌重塑的影響*

邵立群，白婷婷，趙 強(qiáng)，王春貴，宣麗穎，王 羽△，趙 明△

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，通遼 028000)

缺血性心肌病是慢性冠脈疾病類型之一，主要表現(xiàn)為心室擴(kuò)大及心力衰竭[1]，其主要原因是由于長(zhǎng)期冠脈缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑。目前認(rèn)為，在細(xì)胞死亡類型中除了壞死和凋亡外，還存在一種Ⅱ型程序性死亡，即自噬。自噬在心臟疾病發(fā)展中具有雙重作用，在一些情況下，自噬可以降解損傷的細(xì)胞器，提供氨基酸及游離脂肪酸，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，但過(guò)度激活卻對(duì)心肌產(chǎn)生損傷[2]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubules associated protein 1 light chain 3, LC3)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬小體和自噬小體膜表面，是細(xì)胞自噬小體膜的通用標(biāo)記物。LC3首先在胞漿中合成并經(jīng)過(guò)加工成可溶性的LC3I，經(jīng)泛素化后，與自噬小體膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3II。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞的損傷與自噬具有相關(guān)性[3]。正常心肌細(xì)胞存在低水平自噬，但在缺血、缺氧等情況下，自噬水平升高[4]。

網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白(calumenin)是一種位于哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)內(nèi)屬于CREC家族具有多個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)的鈣離子(Ca2+)結(jié)合蛋白，與雷諾定受體2(ryanodine receptor2，RyR2)通道及Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2a)相互作用調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣釋放，鈣回?cái)z與儲(chǔ)存，共同維持鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)[5]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，calumenin蛋白保護(hù)心肌細(xì)胞，但具體機(jī)制尚不明確。

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，始于《神農(nóng)本草經(jīng)》。隨著現(xiàn)代藥學(xué)工藝發(fā)展，傳統(tǒng)中藥在劑型上發(fā)展迅速，黃芪注射液為黃芪的一種劑型，其在臨床上治療心血管疾病效果顯著。黃芪注射液通過(guò)抑制磷酸二酯酶活性，消除氧自由基，進(jìn)而改善心衰患者心功能，減輕患者臨床癥狀和體征[6]。本團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可有效改善阿霉素心肌病大鼠心臟功能，但對(duì)缺血性心肌病作用尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_黃芪注射液對(duì)缺血性心肌病心臟功能的作用及作用產(chǎn)生機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

36只體重180～220 g雄性SD大鼠，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXKs(吉)2011-0004。黃芪注射液(成都地奧九泓制藥廠)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021776，規(guī)格: 每支10 ml, 黃芪注射液的規(guī)格為每支10 ml含原藥材20 g 每ml含黃芪原藥2 g。麻醉藥品氨基甲酸乙酯購(gòu)買(mǎi)自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司。calumenin抗體，LC3-I抗體、LC3-II抗體購(gòu)自Boster公司，內(nèi)參β-actin及GAPDH購(gòu)自wanleibio公司；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司。光學(xué)顯微鏡(Olympus)和H-600型電子顯微鏡(日立，日本)。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制備及分組

選體重180～220 g清潔級(jí)雄性大鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血性心肌病組、黃芪注射液組。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。缺血性心肌病組和黃芪注射液組大鼠用20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開(kāi)頸部皮膚并分離氣管，做氣管插管與人工呼吸機(jī)相連，按肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)нB接BL420生理儀記錄心電圖。沿胸骨左緣第二，三肋間隙迅速打開(kāi)心包，暴露心臟，用0/3號(hào)縫合線從左心耳下緣1 mm 處進(jìn)針，于肺動(dòng)脈圓錐左緣出針，將心臟復(fù)位，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)閉胸腔，觀察心電圖變化，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型成功的標(biāo)志，缺血20 min后，迅速打開(kāi)胸腔，解開(kāi)結(jié)扎線行再灌注，關(guān)胸并記錄心電圖變化。以R波消失，ST段弓背抬高，解開(kāi)結(jié)扎線行再灌注后，ST段回落大于50%，為模型制備成功。手術(shù)結(jié)束關(guān)閉及縫合胸腔，關(guān)閉呼吸機(jī)拔出氣管插管縫合氣管創(chuàng)口及頸部皮膚，模型建立成功后。黃芪注射液組每次注射黃芪注射液10 g/kg 體重，每周注射1次，每次注射容積為1 ml，共注射4次；模型組給予相同容積的生理鹽水注射。

1.3 心臟彩超檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第4周，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，行心臟超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)變化相關(guān)指標(biāo)舒張期室間隔厚度(diastolic interventricular septal thickness, iVSD)及心臟功能相關(guān)指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)。

1.4 病理取材及切片制作

第4周心臟彩超檢查后，立即處死大鼠，在無(wú)菌狀態(tài)下剪開(kāi)大鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟，將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，將心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE、VG染色，于光鏡下觀察病理變化。同時(shí)取左心室組織放入4%戊二醛溶液固定，準(zhǔn)備行電鏡觀測(cè)超微組織變化。

1.5 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中calumenin、LC3-I、LC3-II表達(dá)

各組大鼠心肌細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，采用Western blot方法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中calumenin與自噬相關(guān)蛋白LC3-I、LC3-II表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺血性心肌病大鼠模型心電圖變化(圖1)

結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后大鼠心電圖變化，R波消失，ST段弓背抬高，而解開(kāi)結(jié)扎線行再灌注后，ST段回落大于50%，出現(xiàn)明顯再灌注心律失常(圖1)。結(jié)果表明，缺血性心肌病大鼠模型造模成功。

Fig. 1 Changes of electrocardiogram in rat model of ischemic cardiomyopathy

2.2 黃芪注射液對(duì)缺血性心肌病大鼠射血分?jǐn)?shù)及心室內(nèi)徑的影響

與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，缺血性心肌病組大鼠手術(shù)后4周心臟超聲檢查心室擴(kuò)大，EF值降低，而給予黃芪注射液4周后的大鼠心臟超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)及功能與對(duì)照組無(wú)明顯改變(圖2，表1)。

Fig. 2 Comparison of echocardiographic results of rats in each group

Tab. 1 Changes of EF and Ivsd in different n=12)

2.3 光鏡下觀察各組大鼠心肌組織的變化

HE染色顯示：與對(duì)照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)水腫；同時(shí)給予黃芪注射液的大鼠心臟心肌纖維紊亂，水腫現(xiàn)象有所緩解。VG染色顯示：與對(duì)照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠心肌纖維明顯增生，同時(shí)給予黃芪注射液的大鼠心肌纖維化降低(圖3)。

Fig. 3 Histopathological changes of myocardium in rats of each group under light microscopy

2.4 電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變

對(duì)照組大鼠心肌電鏡下肌節(jié)完整，線粒體清晰，心肌纖維排列整齊，缺血性心肌病大鼠線粒體空泡化嚴(yán)重，心肌纖維排列紊亂，肌節(jié)完整性受損，黃芪注射液組大鼠心肌組織電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，少許線粒體空泡，心肌纖維排列尚整齊(圖4)。

Fig. 4 Ultrastructural changes of myocardium in rats of each group under electron microscopy

2.5 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織中calumenin、LC3-I、LC3-II表達(dá)變化

與對(duì)照組比較，缺血性心肌病組大鼠心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)減少，LC3-II/LC3-I比值表達(dá)明顯增加(P<0.01)，與缺血性心肌病組大鼠比較，黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)calumenin表達(dá)增加，LC3-II/LC3-I比值表達(dá)降低(P<0.01，圖5，表2)。

Fig. 5 The expressions of LC3-II/LC3-I and calumenin in different group

Tab. 2 The expressions of LC3-II/LC3-I and Calumenin by Western blot in different groups(n=3)

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)發(fā)生時(shí)，易引發(fā)心功能障礙，血流動(dòng)力學(xué)指數(shù)異常，研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡參與心肌IRI損傷的病理過(guò)程，心肌缺血和再灌注均可引起心肌細(xì)胞凋亡，I/RI中，細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡存在著復(fù)雜的相互作用[7]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3I、LC3II、BeclinI及LC3II/LC3I比值增加[8]，并且，calumenin表達(dá)減少可引發(fā)心肌細(xì)胞鈣超載導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路使細(xì)胞凋亡增加[9，10]。LC3是自噬形成中重要的一個(gè)組分，LC3結(jié)合系統(tǒng)的目的是進(jìn)行磷脂化。LC3蛋白在細(xì)胞中存在兩種剪切形式LC3-I和LC3-II。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性心肌病大鼠有明顯的心肌重塑，同時(shí)存在心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)減少，細(xì)胞自噬增加，LC3-I/LC3-II比值表達(dá)明顯增加。分析其原因，可能是由于心肌細(xì)胞缺血、缺氧后線粒體受損，影響心肌細(xì)胞氧化磷酸化，ATP產(chǎn)生減少，進(jìn)而引發(fā)calumenin表達(dá)減少，心肌細(xì)胞發(fā)生鈣超載，引發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路使心肌細(xì)胞凋亡增加。凋亡使工作心肌細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少，而導(dǎo)致心肌收縮力下降，出現(xiàn)心力衰竭。中醫(yī)認(rèn)為，正常的心臟功能依靠氣來(lái)推動(dòng)，心主行血，這是中醫(yī)學(xué)最基本的觀點(diǎn)。而黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，為補(bǔ)氣要藥，具有“益氣固表，扶正祛邪”之功效。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可增加缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞calumenin表達(dá)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞鈣超載，抑制缺血性心肌病大鼠心肌重塑及細(xì)胞自噬；LC3-I/LC3-II比值表達(dá)降低，改善缺血性心肌病大鼠心臟功能。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分明確傳統(tǒng)中藥黃芪“補(bǔ)氣”作用機(jī)制，至于心肌細(xì)胞缺血缺氧引發(fā)calumenin表達(dá)減少并導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載具體機(jī)制，還有待以后進(jìn)一步研究。