有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠PPARα信號(hào)通路的影響及其與PPARγ關(guān)系*

王天源，王曉慧

(上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

糖脂代謝紊亂如高血糖、高血脂和胰島素抵抗(insulin resistance, IR)在肥胖及肥胖相關(guān)疾病如2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。有氧運(yùn)動(dòng)能改善紊亂的糖脂代謝，是預(yù)防和治療糖尿病的有效方式之一，但運(yùn)動(dòng)改善糖尿病糖脂代謝紊亂的機(jī)制，目前仍未完全闡明。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)是脂類代謝的主要調(diào)節(jié)因子，有三個(gè)成員，PPARα，PPARγ和PPAR/σ[1]。PPARα是游離脂肪酸受體，在脂肪酸β氧化、能量代謝等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是目前糖尿病治療的研究熱點(diǎn)之一。據(jù)報(bào)道PPARα通過調(diào)節(jié)肝臟中脂肪酸的攝取和代謝，降低極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)與甘油三酯(triglycerides, TG)產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)TG的水解和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein HDL)的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)降血脂的作用[2]。PPARα發(fā)揮作用需被其上游信號(hào)分子腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK)激活[3]；而PPARα最主要的下游靶分子是肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitine palmitoyl transferase 1, CPT1)。研究已證實(shí)，一些激活A(yù)MPK-PPARα-CPT1通路的藥物能改善肥胖及肥胖相關(guān)疾病的脂代謝[4]。運(yùn)動(dòng)也可通過上調(diào)該通路來改善肥胖及肥胖相關(guān)疾病的脂代謝，但也有完全相反的研究報(bào)道，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)對(duì)該通路的下調(diào)才能改善脂代謝[5]。因此，運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK-PPARα-CPT1通路的調(diào)控及意義尚未完全闡明。PPARγ也是肥胖、糖尿病等疾病治療的主要靶分子之一，在調(diào)控糖脂代謝和胰島素敏感性等方面也起重要作用[6]。多不飽和脂肪酸是PPARγ的天然配體，它們激活PPARγ后能增加葡萄糖攝取和胰島素敏感性，從而在調(diào)控糖脂代謝中起關(guān)鍵作用。運(yùn)動(dòng)增加PPAR水平，且PPAR的增加與糖脂代謝改善有關(guān)[7]。

目前PPARα與PPARγ單獨(dú)信號(hào)通路在肥胖及肥胖相關(guān)疾病中作用的研究較多，但它們之間是否存在相互作用仍不清楚；而運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下兩者的作用是否有關(guān)聯(lián)，目前仍鮮有報(bào)道。因此，本研究首先證實(shí)PPARα信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠血糖血脂和脂肪肝中的作用，然后利用PPARγ的抑制劑和激動(dòng)劑來研究PPARα的作用是否依賴PPARγ，以及PPARγ對(duì)PPARα是否有調(diào)控作用，這將為有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病患者血糖血脂水平提供新的理論依據(jù)

1 材料與方法

1.1 大鼠建模、分組和訓(xùn)練方案

6周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只(200±10)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006)，飼養(yǎng)于上海體育學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲食、飲水，室溫控制在20～24℃，空氣相對(duì)濕度為40%～55%，明暗周期為12 h∶12 h。隨機(jī)選取8只大鼠喂以普通飼料作為安靜對(duì)照組(Con)，其余大鼠采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)建立糖尿病(DM)模型大鼠。具體方法：高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，一次性空腹腹腔注射小劑量(30 mg/kg)的STZ，在注射后第3日和第7日檢測(cè)大鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，兩次均高于11.1 mmol/L則為建模成功。

將建模成功的DM大鼠隨機(jī)分為4組：DM組、DM運(yùn)動(dòng)組(TDM)、TDM+PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮組(TDP)、TDM+PPARγ抑制劑GW9662組(TDG)，每組8只。所有運(yùn)動(dòng)組大鼠先進(jìn)行3 d跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，之后進(jìn)行遞增負(fù)荷的4周中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練，每周6 d，每天1次。第1、2周跑速為15 m/min，訓(xùn)練時(shí)間從30 min增加至60 min；第3、4周跑速為20 m/min，訓(xùn)練時(shí)間從60 min增加至90 min。每次訓(xùn)練前30 min，TDP和TDG組大鼠分別灌胃補(bǔ)充吡格列酮(10 mg/kg體重)和GW9662(1 mg/kg體重)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間所有大鼠使用普通飼料喂食。本研究得到上海體育學(xué)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2016004)。

1.2 血液和組織樣本采集

在最終運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束后36 h，大鼠禁食12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈取血，收集血清。采血后處死大鼠，采集肝和腓腸肌(糖尿病大鼠無腎周脂肪，故未收集)，保存于-80℃冰箱。

1.3 空腹血糖血脂檢測(cè)

4周運(yùn)動(dòng)前、后，大鼠在禁食12 h 后尾靜脈取血，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)水平。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL)水平，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.4 Western blot檢測(cè)肝臟和骨骼肌PPARα等蛋白表達(dá)水平

取適量肝或腓腸肌，加入適量體積的蛋白酶裂解液，機(jī)械勻漿后超聲裂解組織，離心(4℃，12 000 r/min，30 min)后取上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg待測(cè)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)好的PVDF膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，然后加入靶蛋白(PPARα、AMPK或CPT1)和內(nèi)參(β-actin和GAPDH)的一抗，4℃封閉過夜，TBST洗3次后加入相應(yīng)的二抗，常溫孵育1 h，TBST洗3次后加入發(fā)光液，用Tanon 5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)曝光目的條帶，ImageJ分析軟件測(cè)定各目的蛋白和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參的灰度值比值表示蛋白表達(dá)相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DM大鼠的空腹血糖血脂水平的影響

如表1所示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，除HDL外，DM大鼠的FBG、TC、TG和LDL水平均比對(duì)照組均顯著升高(P均<0.01)；而4周訓(xùn)練后，TDM與DM組相比，F(xiàn)BG和TG(P<0.05)以及TC和LDL均顯著降低(P均<0.01)。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DM大鼠肝和骨骼肌AMPK-PPARα-CPT1的蛋白表達(dá)水平的影響

如圖1所示，大鼠肝(A)和腓腸肌(B)的PPARα蛋白表達(dá)水平，DM組比Con組顯著降低(P<0.05)，而TDM組比DM組顯著提高(P<0.05)。

Tab. 1 Blood glucose and blood lipid in DM rats were improved by 4-week aerobic exercise(mmol/L， n=8)

Fig. 1 Effects of 4-week aerobic training on the protein levels of PPARα in the liver(A)and gastrocnemius(B)of DM rats

類似地，大鼠肝(圖2A)和腓腸肌(圖2B)的AMPK蛋白表達(dá)水平，DM組比Con組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而TDM組比DM組顯著提高(P<0.01)。

Fig. 2 Effects of 4-week aerobic training on the protein levels of AMPK in the liver(A)and gastrocnemius(B)of DM rats

此外，如圖3所示，4周訓(xùn)練顯著增加DM組大鼠肝(A)和腓腸肌(B)的CPT1蛋白水平(P< 0.01)，盡管DM組大鼠只有肝CPT1水平比Con組顯著降低(P<0.05)、而腓腸肌的無顯著改變。

Fig. 3 Effects of 4-week aerobic training on the protein levels of CPT1 in the liver(A)and gastrocnemius(B)of DM rats

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DM大鼠PPARα的上調(diào)作用是否與PPARγ有關(guān)？

2.3.1 PPARγ激動(dòng)劑與抑制劑對(duì)運(yùn)動(dòng)DM大鼠PPARα蛋白表達(dá)水平的影響 如圖4所示，與TDM組相比，TDP組大鼠(外源補(bǔ)充PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮)的肝(A)和腓腸肌(B)PPARα蛋白水平顯著提高(P<0.01)，但外源補(bǔ)充PPARγ抑制劑GW9662的TDG組大鼠與TDM組相比，PPARα蛋白水平無顯著差異(P>0.05)。

Fig. 4 Effects of PPARγ agonist and antagonist on PPARα protein expression in the liver and gastrocnemius of trained DM rats

2.3.2 PPARγ激動(dòng)劑與抑制劑對(duì)運(yùn)動(dòng)DM大鼠CPT1蛋白表達(dá)水平的影響 CPT1的結(jié)果與PPARα的類似。即與TDM組相比，TDP組大鼠肝(圖5A)和腓腸肌(圖5B)的CPT1蛋白水平顯著提高(P<0.01)，而與TDM組比較，TDG組的CPT1蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

Fig. 5 Effects of PPARγ agonist and antagonist on CPT1 protein expression in the liver and gastrocnemius of trained DM rats

2.3.3 PPARγ激動(dòng)劑與抑制劑對(duì)運(yùn)動(dòng)DM大鼠AMPK蛋白表達(dá)水平的影響 如圖6所示，與TDM組相比，TDP組大鼠肝(A)和腓腸肌(B)的AMPK蛋白水平顯著提高(P<0.01)，與TDM組比較，TDG組的肝AMPK蛋白水平無顯著差異(P>0.05)、腓腸肌AMPK的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

Fig. 6 Effects of PPARγ agonist and antagonist on AMPK protein expression in the liver and gastrocnemius of trained DM rats

3 討論

作為脂質(zhì)感受器以及脂肪酸氧化驅(qū)動(dòng)器，PPARα參與脂肪酸氧化、脂質(zhì)代謝和炎癥調(diào)節(jié)。PPARα激活導(dǎo)致脂肪氧化、并減少脂肪儲(chǔ)存。反之，PPARα減少導(dǎo)致脂肪酸氧化減少、脂肪增多，在肥胖及肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。例如，肝PPARα表達(dá)降低可引起肝脂肪變性和脂肪性肝炎的發(fā)生[8]；PPARα缺陷小鼠存在嚴(yán)重的肝臟脂肪積累和心臟脂肪化[9]。也因此，PPARα合成激動(dòng)劑貝特類被用作肥胖及肥胖相關(guān)疾病降血脂的治療藥物。除了最為熟知的降血脂作用外，近年來發(fā)現(xiàn)PPARα還能調(diào)控胰島素敏感性。例如，PPARα敲除小鼠不僅有高血脂、脂肪肝，還出現(xiàn)胰島素抵抗；脂肪組織特異性PPARα過表達(dá)小鼠，其胰島素敏感性提高[10]。PPARα要發(fā)揮作用離不開其上游信號(hào)分子AMPK的激活，以及它最重要下游分子CPT1來實(shí)現(xiàn)功能。AMPK是能量感受器，在脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性上起關(guān)鍵作用[3]，CPT1是轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體的脂肪酸氧化限速酶，對(duì)脂肪酸攝取和氧化具有重要調(diào)節(jié)作用。

有氧運(yùn)動(dòng)是減輕肥胖、改善糖脂代謝紊亂、防治肥胖相關(guān)疾病的有效方法和主要方式，其機(jī)制與運(yùn)動(dòng)對(duì)PPARα的調(diào)控有關(guān)。例如，跑步、游泳等有氧運(yùn)動(dòng)可通過上調(diào)肝或心肌PPARα的蛋白表達(dá)來改善糖尿病、代謝綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的脂代謝。然而，也有相反的報(bào)道，認(rèn)為有氧運(yùn)動(dòng)是通過降低肝或心肌PPARα蛋白水平來改善肥胖和糖尿病大鼠的脂代謝。分析相反結(jié)果的原因，可能是PPARα蛋白水平在后者的肥胖和糖尿病大鼠中是增加的緣故。運(yùn)動(dòng)能提高大鼠股四頭肌與肝臟AMPK活性[11]，運(yùn)動(dòng)也能激活野生型小鼠的PPARα及CPT1，且運(yùn)動(dòng)對(duì)野生型小鼠PPARα的激活作用依賴于AMPK的激活[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠的PPARα和AMPK、CPT1的蛋白水平均降低；而4周有氧運(yùn)動(dòng)在改善糖尿病大鼠血糖血脂[13]的同時(shí)，增加肝和腓腸肌PPARα和AMPK、CPT1的蛋白水平，提示外周代謝器官(如肝和骨骼肌)AMPK-PPARα-CPT1通路的激活是有氧運(yùn)動(dòng)改善DM大鼠血糖血脂的機(jī)制之一。類似的研究結(jié)果在本課題組的其他研究中也被證實(shí)，即運(yùn)動(dòng)改善肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血糖血脂的作用與運(yùn)動(dòng)增加肝、骨骼肌和脂肪AMPK、PPARα和CPT1蛋白水平有關(guān)[14]。PPARα主要在富含線粒體和脂肪酸分解代謝率高的器官或組織(如肝臟，心臟和骨骼肌)中表達(dá)[15]。本研究證實(shí)有氧運(yùn)動(dòng)不僅增加糖尿病大鼠肝PPARα蛋白水平，還增加腓腸肌的PPARα蛋白水平；而運(yùn)動(dòng)增加糖尿病大鼠腓腸肌PPARα蛋白水平，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

PPARγ主要表達(dá)于肝和白色脂肪組織[16]，PPARγ最熟知的是調(diào)控糖代謝的重要作用，包括增加葡萄糖攝取、抑制糖異生和提高胰島素敏感性等[17]。近年的研究發(fā)現(xiàn)PPARγ對(duì)脂代謝也起關(guān)鍵作用，如PPARγ激活能減少大鼠骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)積累、減輕脂肪肝模型小鼠的肝臟脂質(zhì)積累[18]等。荷葉水提物促進(jìn)脂肪動(dòng)員和分解,降低肥胖大鼠體重和血脂的作用與其改善大鼠脂肪組織PPARγ的表達(dá)有關(guān)[19]。我們課題組前期的研究證實(shí)，4周有氧運(yùn)動(dòng)改善糖尿病大鼠血糖血脂的作用與運(yùn)動(dòng)增加PPARγ表達(dá)，進(jìn)而增加糖脂代謝關(guān)鍵酶有關(guān)[13]。

盡管PPARα與PPARγ受不同基因編碼，在不同組織中表達(dá)程度不同，但兩者結(jié)構(gòu)相似，功能相近，它們之間是否有相互作用？目前這方面的研究報(bào)道很少。僅有的研究報(bào)道PPARγ激動(dòng)劑(如二甲雙胍和羅格列酮)可通過激活A(yù)MPK間接激活PPARα[20]。鑒于有氧運(yùn)動(dòng)能調(diào)控這兩種PPARs，且這兩種PPARs均能調(diào)控糖脂代謝和胰島素敏感性，我們推測(cè)在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下PPARγ和PPARα之間可能有調(diào)節(jié)作用，但尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為明確此問題，本文利用PPARγ特異性抑制劑GW9662(僅對(duì)PPARγ有抑制作用，并不會(huì)抑制PPARα表達(dá)[15])來研究4周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠AMPK-PPARα-CPT1的激活是否依賴PPARγ。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GW9662對(duì)運(yùn)動(dòng)糖尿病大鼠的PPARα和CPT1的蛋白水平無顯著影響，僅顯著降低骨骼肌AMPK的蛋白水平，表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠PPARα及CPT1的上調(diào)不依賴于PPARγ，但對(duì)骨骼肌AMPK的上調(diào)至少部分是通過PPARγ介導(dǎo)。此外，本文還利用PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮來研究有氧運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下PPARγ激動(dòng)劑是否能進(jìn)一步上調(diào)運(yùn)動(dòng)糖尿病大鼠PPARα信號(hào)通路蛋白的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARγ的激活可進(jìn)一步增加運(yùn)動(dòng)糖尿病大鼠的AMPK-PPARα-CPT1蛋白水平。類似地，Piché ME等人的研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激活可進(jìn)一步增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病成年男性血壓的降低作用[21]。

值得一提的是，已有研究報(bào)道，PPARα激動(dòng)劑和PPARγ激動(dòng)劑的聯(lián)合使用比單用任一種激動(dòng)劑有更好的改善血糖血脂作用。例如非諾貝特(廣泛應(yīng)用于臨床治療的PPARα激動(dòng)劑)和吡格列酮各一半劑量的合用比任一全劑量的單激動(dòng)劑，能更好地降低非酒精性脂肪肝大鼠血清和肝臟的TC和TG水平[22]。相反，PPARα抑制劑MK886和PPARγ抑制劑GW9662聯(lián)合使用，可使脂肪肝大鼠的血清、肝臟TC、TG水平升高得更顯著[15]。PPARα和PPARγ同時(shí)激活不僅比單一激動(dòng)劑的作用更好，而且可減輕單一激動(dòng)劑的副作用(如體重增加是TZDs在臨床上的一個(gè)典型不良效果)，因此，PPARα/γ雙重激動(dòng)劑的發(fā)現(xiàn)和合成成為目前的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道PPARα/γ雙重激動(dòng)劑的作用可能是由于它更好地改善瘦素及脂聯(lián)素的平衡以及調(diào)控糖脂代謝關(guān)鍵酶實(shí)現(xiàn)的[22]。

總之，4周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DM大鼠血糖血脂的改善作用與運(yùn)動(dòng)激活肝和腓腸肌的AMPK-PPARα-CPT1通路有關(guān)。運(yùn)動(dòng)對(duì)DM大鼠PPARα通路的激活與PPARγ無關(guān)，但PPARγ激活具有進(jìn)一步增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK-PPARα-CPT1蛋白水平上調(diào)的作用。