大負荷運動誘導大鼠骨骼肌損傷對其自噬超微結構及Beclin1和LC3-II/I的影響*

張 欣，王瑞元

(1.南京體育學院運動健康科學學院，江蘇 南京 210014；2.北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084)

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核生物中的溶酶體依賴性降解途徑。正常自噬可通過降解代謝廢物或大分子有用物質維持細胞生存和代謝再利用[1]；自噬過度激活能引起細胞異化作用增強或影響細胞的完整性，進而產(chǎn)生負面效果[2]。近年來運動與骨骼肌自噬水平的研究備受關注。已知適度運動能通過增強自噬流進而恢復自噬受損類大鼠骨骼肌肌肉炎癥[3]。在細胞老化的過程中，經(jīng)常給予骨骼肌細胞自噬刺激，有益于保持肌肉正常的生理狀態(tài)[4]。但有關大負荷離心運動對骨骼肌細胞自噬水平的影響尚未見報道。

目前反應自噬水平的相關蛋白主要是Beclin1和LC3-II/I。Beclin1是第一個在哺乳動物中被確認的調節(jié)自噬的相關基因，是自噬體形成過程中的必需分子，能介導其他自噬蛋白定位于吞噬泡，調控哺乳動物自噬體的形成與成熟，與自噬活性密切相關[5]。自噬時，LC3-I合成后通過對本身羧基末端的甘氨酸殘基修飾剪切，與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結合,形成LC3-II。LC3-II定位于自噬前體和自噬體，其含量與自噬泡數(shù)量成正比，LC3-II/I可用于評價自噬水平[6]。

本研究建立一次大負荷離心運動誘導的大鼠骨骼肌損傷模型[7]，透射電子顯微鏡和免疫熒光共同觀察運動后72 h內骨骼肌細胞的自噬情況，Western blot觀察大鼠骨骼肌Beclin1和LC3-II/I表達變化，探討一次大強度離心運動對骨骼肌細胞自噬的影響，為運動性骨骼肌損傷機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

健康雄性8周齡SPF級SD大鼠共48只，(212.19±6.64)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。于北京體育大學實驗動物房每籠4只分籠飼養(yǎng)、定時訓練，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照/黑暗晝夜光12 h交替，自由飲水飲食。適應性訓練前，實驗大鼠于屏障式動物房正常生長適應3 d。

1.2 實驗動物分組與干預方案

將48只實驗大鼠隨機分為對照組(Control, C，n=8)和運動組(Exercise, E，n=40)。C組參與適應性訓練后，安靜飼養(yǎng)。E組根據(jù)運動后的時間點分為5組(n=8)：即刻組(E0)、運動后12 h組(E12)、運動后24 h組(E24)、運動后48 h組(E48)和運動后72 h組(E72)。

大負荷離心運動方案：延續(xù)跑臺坡度-16°，速度16 m/min，持續(xù)運動90 min 導致比目魚肌肌纖維損傷的Armstrong離心運動模型[7]。動物跑臺運動干預前，所有實驗大鼠均經(jīng)過3 d無干預喂養(yǎng)和3 d適應性跑臺訓練。適應性跑臺訓練跑臺坡度0°，速度16 m/min，期間確保實驗大鼠無疲勞無損傷，第1日持續(xù)訓練5 min；第2日持續(xù)訓練10 min；第3日休息。第4日正式實驗。

1.3 實驗標本取樣

實驗大鼠分別在安靜和運動后即刻、12 h、24 h、48 h和72 h時分批處死并取材。所有大鼠取材前稱量空腹體重，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹，腹腔靜脈抽血處死。分離并剪取比目魚肌，置于冰浴中的錫紙上，小心去除兩側肌腱和結締組織。取材過程中，盡量避免肌肉牽拉。把處理后的比目魚肌肌腹切成三段，其中一段大小為l mm×1 mm×3 mm,立即投入4℃預冷的Pon-812環(huán)氧樹脂包埋,4℃保存，用于透射電子顯微鏡觀察；剩余部分平均分成兩段，一段放OCT包埋后迅速置于液氮預冷的異戊烷快速冷凍，之后放于-80℃超低溫冰箱保存，用于骨骼肌細胞中自噬蛋白的定量熒光測定，另一段用錫紙包裹后迅速投入液氮冷凍，并于-80℃冰箱保存，待Western blot蛋白測定。

1.4 測試指標及方法

1.4.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌自噬體的變化 將比目魚肌1)戊二醛固定；2)鋨酸固定；3)酒精脫水；4)置換；5)純樹脂包埋；7)制備切片；8)JEM-1400透射電鏡觀察。

1.4.2 免疫熒光技術檢測骨骼肌細胞LC3定位(LC3單染) 1)冰凍切片制作；2)多聚甲醛浸泡并固定切片；3)免疫組化筆標識樣本范圍；4)封閉；5)一抗孵育：除血清，LC3一抗?jié)舛?∶100，37℃孵育1 h后4℃過夜；6)二抗孵育：經(jīng)過夜孵育切片PBS洗3次，每次20 min，避光條件下，LC3二抗?jié)舛?∶200，37℃孵育1 h；7)封片；8)圖像采集及分析。

1.4.3 Western blot方法測定骨骼肌細胞LC3II/I和Beclin1的蛋白含量 1)骨骼肌組織蛋白提??；2)SDS-PAGE 凝膠電泳按配方配膠；3)上樣；4)電泳；5)轉膜：；6)封閉；7)一抗孵育；8)洗膜；9)二抗孵育；10)洗膜；11)凝膠成像。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一次大負荷離心運動對骨骼肌自噬體形態(tài)和分布的影響

透射電子顯微鏡觀察一次大負荷離心運動后骨骼肌細胞內自噬體的形成和變化見圖1。結果顯示，對照組大鼠骨骼肌肌原纖維排列整齊，肌節(jié)有明顯的規(guī)律性和重復性。線粒體大小不一，均勻地分布于Z線兩側，肌膜下方亦有線粒體分布，形態(tài)多為立體長線或卵圓形，雙層膜包裹，內部嵴結構清晰可見。肌纖維縱切面電鏡圖片中，很難找到典型的由雙層膜碗狀結構形成的自噬前體或由單層膜包繞細胞器的自噬體。運動后即刻，大鼠骨骼肌肌原纖維出現(xiàn)明顯的牽拉性損傷，牽拉部位肌小節(jié)破壞嚴重，線粒體結構出現(xiàn)異常，腫大并向肌膜下聚集,自噬體不明顯。運動后12 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷程度并未發(fā)生明顯改善，肌漿網(wǎng)管腔變大腫脹，出現(xiàn)明顯空泡化，三聯(lián)體有移位現(xiàn)象。肌原纖維間和肌膜下方均能找到內含線粒體、核糖體等細胞器的自噬體，且數(shù)量相對較多。運動后24 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷部位肌小節(jié)逐漸恢復，肌膜下或肌原纖維間仍有自噬體出現(xiàn)，但出現(xiàn)概率低。運動后48 h直至72 h，電鏡視野下幾乎觀察不到自噬體存在，肌原纖維及其周邊的細胞器均與對照組比較無明顯差異。

Fig. 1 Skeletal muscle myofibrils of rats under high power electron microscopy

2.2 一次大負荷離心運動對骨骼肌自噬蛋白免疫熒光的影響

為了更好的探究一次大負荷離心運動后自噬蛋白的變化，本實驗在免疫印跡法的基礎上，選取對應受試大鼠比目魚肌制作冰凍切片，通過激光共聚焦技術檢測自噬蛋白LC3在骨骼肌中的數(shù)量和分布(圖2，表1)。每張切片均按照相同參數(shù)隨機采集5個視野，三組各采集3個，共計15個樣本統(tǒng)計分析(圖2見彩圖頁Ⅰ)。

2.3 一次大負荷離心運動對骨骼肌Beclin1和LC3-II/I蛋白表達的影響

一次大負荷離心運動后，骨骼肌自噬蛋白Beclin1、LC3-II/I變化如圖3，表2所示。由圖表可以看出，一次大負荷離心運動后即刻，自噬蛋白Beclin1表達顯著升高(P<0.05)，在運動后12 h和24 h達到峰值(P<0.01，兩時間點間沒有顯著性差異)，運動后72 h逐漸恢復至與基礎值無顯著性差異。自噬蛋白LC3-II/I表達具有類似的變化趨勢，一次大負荷離心運動后即刻，自噬蛋白LC3-II/I表達顯著升高(P<0.05), 運動后12 h達到峰值(P<0.05)，運動后72 h逐漸恢復至與基礎值無顯著性差異。

Fig. 3 Beclin1 and LC3-II/I relative protein amount changes after a high-load exercise

3 討論

本研究中，一次大負荷離心運動后即刻，完整視野下骨骼肌細胞雙層膜結構相對較多，觀測明顯，但不排除源于損傷導致的細胞器雜亂無序，尤其是肌漿網(wǎng)被嚴重破壞。一般來說，自噬初期，在自噬誘導信號的干預下，胞漿中形成微小的雙層膜結構，像“碗”一樣伸縮擴張，盡管自噬體膜形成位置尚未明確，觀點多集中于高爾基體[8]、內質網(wǎng)[9]或線粒體[10]。自噬中期，雙層膜結構持續(xù)延伸，將胞漿中的任意成分包繞入“碗”中，形成完整密閉的球狀自噬體，雙層膜結構及其包含的線粒體、內質網(wǎng)碎片等成分，是電鏡觀察到自噬體的標準。本研究一次大負荷離心運動后12 h，完整視野下雙層膜結構增多，細胞器出現(xiàn)空泡化，結構不完整或消失，推測細胞自噬已大量啟動。自噬末期，成形后的自噬體與細胞內的吞噬泡、內體和吞飲泡融合，隨后自噬體內膜被溶酶體酶降解，有用產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等，被輸送至胞漿供細胞重新利用，無用殘渣被排出細胞外[11]。本研究一次大負荷離心運動后24 h，自噬小泡多以自噬溶酶體的形式出現(xiàn)，且自噬鏡頭相對不易捕捉，說明骨骼肌纖維的自噬水平趨于末期的自噬溶酶體溶解和信息處理階段；運動后48 h完整視野下自噬體很難捕捉，電鏡圖像中可以見到肌原纖維損傷部位，三聯(lián)體逐漸成型；運動后72 h電鏡下肌原纖維超微結構與安靜狀態(tài)下相差無異，表明一次大負荷離心運動誘導的骨骼肌損傷基本恢復。

Tab. 1 Immunofluorescence intensity of light chain 3(LC3)after a high-load n=8)

Tab. 2 Relative protein amount of Beclin1 and LC3-II/LC3-I after a high-load exercise

目前反應自噬水平的相關蛋白主要是Beclin1和LC3-II/I。Beclin1是首例哺乳動物中確認自噬調節(jié)蛋白基因，能介導其他自噬蛋白定位于吞噬泡，調控哺乳動物自噬體的形成與成熟，是自噬體形成過程中的必需分子。LC3是自噬標志蛋白之一，廣泛存在于哺乳動物的組織和細胞，其表達程度與自噬活性密切相關，評價自噬水平往往通過LC3-II/I[12]。LC3-I、LC3-II是有共同基因編碼的蛋白，區(qū)別于蛋白修飾不同。有研究者讓小鼠在跑臺運動1 h或急性鈍挫傷干預，骨骼肌細胞的自噬標志蛋白含量均明顯升高[13]。Jamart的人體肌肉活檢研究也得出相同的結論[14]。在本研究中，給予大鼠一次大負荷離心運動干預，發(fā)現(xiàn)隨著時間的變化，自噬蛋白Beclin1蛋白量在運動后即刻、12 h、24 h和48 h顯著性上升，分別至基礎值的1.870、2.112、2.128和1.853倍；LC3-II/I在運動后即刻、12 h和48 h三個時間點運動前相比有顯著性差異，分別升至基礎值的2.783、2.972和1.581倍。說明一次大強度離心運動誘導骨骼肌細胞自噬增強。為進一步探究一次大負荷離心運動后骨骼肌細胞自噬體的變化，本研究通過激光共聚焦技術檢測并分析自噬蛋白LC3在骨骼肌中的數(shù)量和分布，結果發(fā)現(xiàn)，一次大負荷離心運動后即刻，12 h、24 h和48 h，自噬蛋白LC3的熒光標記強度分別顯著性高于對照組基礎熒光強度的1.490、3.339、3.340和2.716倍，這與電鏡下觀察到骨骼肌細胞自噬體活躍程度和自噬蛋白檢測結果基本一致，進一步說明一次大負荷離心運動顯著誘導骨骼肌細胞自噬。

運動對自噬的影響因素尚待確定。前期有研究報道，缺氧缺糖可誘導損傷肌細胞自噬增強[15]，提示此現(xiàn)象可能與運動代謝特點有關。本研究的大強度離心運動過程中，骨骼肌長時間處于急劇收縮狀態(tài)，消耗大量的能量，并產(chǎn)生大量代謝中間產(chǎn)物或有害物質，容易造成骨骼肌內蛋白表達障礙，損害細胞器功能，此時，細胞可以通過適當?shù)淖允赏緩剑淌晒δ苁軗p的細胞器，代謝中間產(chǎn)物或清除有害物質，以便細胞能有效地為機體供能。一些研究還發(fā)現(xiàn)，運動引起的骨骼肌自噬激活取決于其強度和持續(xù)時間[16]。長時間耐力運動誘導自噬基因程序啟動，自噬體表達含量上調，但一次中等強度運動60～120 min后，自噬體的含量反而會降低[17]。這表明，在運動過程中，大強度嚴重缺氧會增加骨骼肌中的自噬蛋白含量，短時間的低強度運動反而會令其恢復。本研究離心運動誘導的骨骼肌自噬可從運動后即刻持續(xù)至運動后48 h，但該結論與已有運動自噬相關研究并不完全一致。其中，有研究報道，適應性運動干預后2～7 d，受試鼠受損肌纖維出現(xiàn)明顯的自噬現(xiàn)象，且溶酶體生化功能異?；钴S[18]；亦有研究報道，大鼠在跑臺急性運動30 min后，自噬蛋白LC3-II即刻升高，運動后3 h即能恢復至基礎水平[19]。推測自噬可能與運動干預方式和干預強度有關。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白表達峰值出現(xiàn)在運動后12 h和24 h，且兩時間點數(shù)值無顯著性差異，LC3-II/I蛋白表達峰值出現(xiàn)在運動后12 h，提示，一次大負荷離心運動后12 h是研究自噬的關鍵時間點。

綜上所述，大負荷離心運動可誘導骨骼肌自噬超微結構變化，自噬蛋白表達增強，對明確運動損傷誘導的骨骼肌功能下降研究具有重要意義。