間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬的激活及減脂效果的比較*

王 禎，于 亮，付 悅

(北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

肥胖是困擾現(xiàn)代社會(huì)人體健康的一大難題，高熱量飲食與體力活動(dòng)不足是其主要誘因，因此飲食調(diào)控與有氧運(yùn)動(dòng)成為減肥的首選措施，然而二者減肥效果的優(yōu)劣卻鮮有報(bào)道。有氧運(yùn)動(dòng)是通過增加機(jī)體熱量消耗，以達(dá)到控制體重效果的一種手段。而飲食調(diào)控則是通過減少機(jī)體能量攝取，降低體內(nèi)脂肪的累積。間歇性禁食(intermittent fasting，IF)是目前較為流行的飲食調(diào)控手段之一，通過一定周期內(nèi)禁食與飲食的交替進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)機(jī)體能量的間歇性虧空，有研究認(rèn)為這種能量虧空形式可能會(huì)產(chǎn)生與有氧運(yùn)動(dòng)類似的效果[1,2]。但也有學(xué)者質(zhì)疑，認(rèn)為熱量攝取的減少會(huì)影響機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量受損[3,4]。

自噬是機(jī)體將自身多余、破損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)經(jīng)溶酶體系統(tǒng)清除的過程。通常生物體自噬活性較低，當(dāng)個(gè)體經(jīng)歷運(yùn)動(dòng)、饑餓等應(yīng)激刺激時(shí)，自噬活性會(huì)發(fā)生不同程度的改變，這種改變效益具有雙面性，一方面自噬若激活程度適宜，則有利于胞內(nèi)破損細(xì)胞器或變性蛋白質(zhì)的清理，促進(jìn)細(xì)胞生存，且可以通過自噬過程降解體內(nèi)“雜物”，減少其對(duì)機(jī)體能量的占用；另一方面當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度過大，自噬水平的過度激活會(huì)引起程序性細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致包括骨骼肌在內(nèi)的相關(guān)組織的損傷，影響其質(zhì)量與功能。

現(xiàn)已知適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可以適度提高機(jī)體自噬水平，給骨骼肌帶來積極影響，但間歇性禁食對(duì)骨骼肌自噬水平的影響卻鮮有報(bào)道。本研究通過建立間歇性禁食和有氧運(yùn)動(dòng)模型，在觀察對(duì)比二者體重控制效果的基礎(chǔ)上，探討其對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響及自噬激活情況，為尋找適宜的控制體重的措施提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)選取清潔級(jí)雄性SD大鼠60只(8周齡，體重280-320 g)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)和訓(xùn)練，溫度20～24℃，晝夜明暗交替各12 h。正式實(shí)驗(yàn)開始前預(yù)適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(Sed)、間歇性禁食組(InF)、有氧運(yùn)動(dòng)組(Exe)，每組20只。此外，各組又分為14 d與28 d兩個(gè)干預(yù)亞組。各組大鼠體重經(jīng)單因素方差分析無顯著性差異(P>0.05)。于每周六下午稱量、記錄體重。

1.2 模型建立

1.2.1 間歇性禁食模型 參考Vasconcelos等(2014)[5]設(shè)計(jì)的大鼠隔日禁食模型，具體干預(yù)方案為間歇性禁食組大鼠單籠飼養(yǎng)，預(yù)適應(yīng)期間根據(jù)前一天喂食量及第二日飼料剩余量計(jì)算各組大鼠每只每日的平均食物攝入量。正式實(shí)驗(yàn)期間采取隔日禁食方案，即單數(shù)日(如1 d、3 d、5 d…27 d)投喂食物，雙數(shù)日(如2 d、4 d、6 d…28 d)斷糧，禁食期間不限制飲水，攝食日根據(jù)計(jì)算給予大鼠每日攝食量的2倍，使大鼠攝入總熱量與安靜組相同。實(shí)驗(yàn)周期分別為14 d、28 d。以上投食、斷食及食物的稱量均在每天同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行(圖1)。

Fig. 1 Intermittent fasting program of rats

1.2.2 有氧運(yùn)動(dòng)模型 有氧運(yùn)動(dòng)組在預(yù)適應(yīng)期間進(jìn)行低速度短時(shí)間的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)速度16 m/min，時(shí)長(zhǎng)60 min，每周訓(xùn)練6 d，跑臺(tái)坡度第一周為0°，從第二周開始調(diào)整為5°，實(shí)驗(yàn)周期分別為14 d、28 d。

1.3 動(dòng)物取材

各時(shí)間點(diǎn)訓(xùn)練完成后，處死前斷食12 h，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，劑量3 mg/kg，腹主動(dòng)脈采血致死。取左右側(cè)比目魚肌置于天平上稱重，計(jì)算濕重指數(shù)，即比目魚肌濕重(g)/體重(g)；分割米粒大小，用OCT包埋轉(zhuǎn)移至-80℃存儲(chǔ)，用于后續(xù)切片實(shí)驗(yàn)；分割同樣大小投入戊二醛中，制備透射電鏡樣品；剩余比目魚肌放入液氮中暫時(shí)貯存，當(dāng)日取材結(jié)束立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存，用于后續(xù)檢測(cè)。除稱量濕重外，其它實(shí)驗(yàn)中的肌肉不區(qū)分左右側(cè)。

1.4 雙能X線吸收測(cè)量法(DEXA)

提前預(yù)熱并校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，雙擊NORLAND圖標(biāo)并設(shè)定程序，大鼠麻醉后放在儀器上，標(biāo)記開始點(diǎn)、結(jié)束點(diǎn)、基點(diǎn)后進(jìn)行掃描，所有大鼠掃描結(jié)束后統(tǒng)一保存、分析數(shù)據(jù)，每組掃描4只(圖2)。體脂指數(shù)(fat mass index)=體脂含量(g)/體重(g)。

1.5 透射電鏡

將戊二醛中的樣本按以下步驟開始實(shí)驗(yàn)：(1)0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗30 min。(2)4℃環(huán)境下1%鋨酸固定2 h。(3)0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗10 min。(4)乙醇梯度脫水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇各10 min。(5)70%乙醇醋酸雙氧鈾染2 h。(6)90%乙醇10 min×2；100%乙醇10 min×3。(7)環(huán)氧丙烷置換10 min。(8)環(huán)氧樹脂EMbed浸透、包埋、聚合。(9)制作1 μm半超薄切片，染色后于光鏡下取像定位，并切取60 μm超薄切片，重金屬染色后，透射電鏡下(×3 000、×6 000)觀察比目魚肌自噬體形態(tài)，每組選取2只進(jìn)行透射電鏡實(shí)驗(yàn)。

Fig. 2 DEXA detects body fat mass

1.6 冰凍切片及免疫熒光

(1)冰凍切片的制作：提前開啟冰凍切片機(jī)預(yù)冷(溫度-20℃)，將樣品放在冰凍切片機(jī)中20 min，以平衡樣品溫度。調(diào)整玻璃板和刀片的角度，用OCT包埋劑澆鑄底座，取出包埋組織，將底部削平并垂直固定在底座上。50 μm粗調(diào)削出組織后，用8 μm細(xì)調(diào)切取組織，貼在備好的載玻片上，待組織霧氣蒸發(fā)后置于顯微鏡下看其形態(tài)，選取肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的載玻片放入-80℃凍存。(2)免疫熒光檢測(cè)laminin：細(xì)胞外層粘連蛋白laminin定位于細(xì)胞外基質(zhì)，利用其定位可檢測(cè)肌纖維橫截面積。取出帶有樣品的防脫載玻片，常溫平衡5 min，按以下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①PBS洗3次，每次5 min；②浸泡在含有0.3% Triton的PBS中破膜30 min；③畫圈后滴加5%羊血清(使用PBS稀釋)，常溫封閉20 min；④滴加含有一抗laminin的5%羊血清(濃度1∶500)，濕盒內(nèi)4℃過夜；⑤次日滴加含有熒光二抗的5%羊血清(濃度1∶500)，避光孵育1 h；⑥載玻片上滴加DAPI封片，待DAPI干后，激光共聚焦顯微鏡拍攝并儲(chǔ)存(放大倍數(shù)：100倍)。圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)、分析單個(gè)肌纖維橫截面積。(3)免疫熒光檢測(cè)LC3：取出帶有樣品的防脫載玻片，常溫平衡5 min，按以下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①浸泡在丙酮中4℃固定10 min；②PBS搖床洗3次，每次5 min；③畫圈后滴加5%羊血清(使用PBS稀釋)常溫封閉20 min；④滴加含有一抗LC3的5%羊血清(濃度1∶100)，濕盒內(nèi)4℃過夜；⑤第2日加入熒光二抗(濃度1∶500)，避光孵育1 h；⑥載玻片上滴加DAPI封片，待DAPI干后，激光共聚焦顯微鏡拍攝并儲(chǔ)存(放大倍數(shù)：630倍)，進(jìn)行定性分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡

剪取比目魚肌100 mg放在EP管中，加1 ml RAPI裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，剪碎并勻漿。靜置30 min后離心(4℃，12 000 r/min，8 min)，取上清轉(zhuǎn)移至新管中。BCA法測(cè)定其濃度，使用5×loading buffer和裂解液將各組濃度調(diào)為一致，沸水變性10 min，室溫冷卻，分裝并移至-40℃冷存?zhèn)溆?。Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及調(diào)控蛋白AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1的表達(dá)。AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、ULK1、p62采用10%分離膠濃度，LC3采用12%分離膠濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，5% BSA對(duì)PVDF膜封閉2 h，使用5% BSA配制一抗AMPKα(濃度1∶500)、p-AMPKα(Thr172)(濃度1∶500)、ULK1(濃度1∶500)、LC3(濃度1∶500)、p62(濃度1∶500)、GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃過夜。目的蛋白二抗?jié)舛?∶1 000，內(nèi)參二抗?jié)舛?∶2 000，常溫孵育1.5 h，TBST清洗后曝光，利用Image Lab 5.1軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響

稱量、計(jì)算單日攝食量發(fā)現(xiàn)，預(yù)適應(yīng)期間大鼠單日平均攝食量為(31.1±12.1)g。干預(yù)14 d時(shí)InF組單個(gè)攝食日的平均攝食量為(35.4±6.7)g。干預(yù)28 d時(shí)InF組單個(gè)攝食日的平均攝食量為(35.9±6.0)g。

每周按時(shí)稱量大鼠體重，數(shù)據(jù)顯示，在干預(yù)期內(nèi)各組大鼠體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，干預(yù)7 d InF、Exe組大鼠體重顯著低于Sed組，InF組大鼠體重顯著低于Exe組(P<0.01)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)延續(xù)該趨勢(shì)(表1)。

14 d、28 d干預(yù)結(jié)束后將大鼠麻醉，使用DEXA檢測(cè)其體脂含量，并計(jì)算體脂指數(shù)，數(shù)據(jù)顯示干預(yù)14 d時(shí)InF、Exe組大鼠體脂指數(shù)低于Sed組，InF組體脂指數(shù)低于Exe組，但無顯著性差異(P>0.05)；干預(yù)28 d時(shí)InF、Exe組大鼠體脂指數(shù)顯著低于Sed組(P<0.05)，且InF組體脂指數(shù)顯著低于Exe組(P<0.01，表2)。

Tab. 1 Effects of intermittent fasting and exercise on body weight of rats(g，

Tab. 2 Effects of intermittent fasting and exercise on fat mass index of rats(×10-2， n=4)

2.2 間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌質(zhì)量的影響

濕重指數(shù)數(shù)據(jù)顯示，14 d和28 d干預(yù)時(shí)長(zhǎng)中InF組、Exe組均高于Sed組，且InF組均高于Exe組，但無顯著性差異(P>0.05，表3)；此外，免疫熒光法檢測(cè)laminin顯示，干預(yù)14 d時(shí)各組肌纖維橫截面積之間差異無顯著性(P>0.05)，干預(yù)28 d時(shí)Exe組肌纖維橫截面積顯著大于Sed與InF組(P<0.01，圖3，表4)。

Tab. 3 Effects of intermittent fasting and exercise on muscle wet weight index of rats(×10-4， n=10)

Fig. 3 Effects of intermittent fasting and exercise on cross-section area of rats soleus muscle(immunofluorescence ×100)

2.3 間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌自噬體形態(tài)的影響

本研究選取透射電鏡觀察骨骼肌中自噬體形態(tài)，結(jié)果顯示Sed組大鼠比目魚肌內(nèi)Z線整齊、線粒體分布均勻、未見明顯自噬體，干預(yù)14 d時(shí)InF組大鼠比目魚肌內(nèi)“雙層膜結(jié)構(gòu)”增加，提示自噬體的增多，Exe組自噬體略有增加，較不明顯，但出現(xiàn)肌節(jié)混亂，線粒體腫大等現(xiàn)象；干預(yù)28 d時(shí)，InF組自噬體數(shù)量仍較Sed組增加，Exe組大鼠比目魚肌內(nèi)自噬體較14 d明顯增多，單位視野面積中自噬體出現(xiàn)幾率增加(圖4)。

Tab. 4 Effects of intermittent fasting and exercise on cross-section area of in rats soleus muscle(μm2， n=10)

Fig. 4 Effects of intermittent fasting and exercise on autophagosome morphology of rats soleus muscle(uncoloured ×3 000 or 6 000)

2.4 間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌自噬分子LC3定位的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sed組相比，InF組、Exe組大鼠比目魚肌中自噬分子LC3在細(xì)胞膜周聚集較多，其中藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為L(zhǎng)C3(圖5)。

Fig. 5 Effects of intermittent fasting and exercise on LC3 localization of rats soleus muscle(immunofluorescence ×630)

2.5 間歇性禁食與運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 比目魚肌LC3、p62蛋白表達(dá)變化 干預(yù)14 d時(shí)，InF組比目魚肌內(nèi)LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平較Sed組升高，但不具有顯著性差異(P>0.05)，p62水平顯著低于Sed和Exe組(P<0.01)，而Exe組LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62蛋白表達(dá)水平與Sed組相比未見差異(P>0.05)。干預(yù)28 d時(shí)，InF組LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ仍較Sed組升高，且p62顯著低于Sed組(P<0.05)；Exe組比目魚肌LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯升高，p62水平明顯降低(P<0.05，圖6，表5)。

Fig. 6 Effects of intermittent fasting and exercise on relative expressions of LC3 and p62 in rats soleus muscle

Tab. 5 Effects of intermittent fasting and exercise on relative expressions of LC3 and p62 in rats soleus muscle n=10)

2.5.2 比目魚肌ULK1蛋白表達(dá)變化 干預(yù)14 d時(shí)，InF組、Exe組比目魚肌ULK1蛋白水平較Sed組顯著增加(P<0.01)，而InF組與Exe組之間未見顯著性差異(P>0.05)(相對(duì)表達(dá)量Sed組為1，InF組為1.35±0.08，Exe組為1.48±0.12)；28 d干預(yù)后InF組、Exe組比目魚肌ULK1水平仍維持在較高水平(圖7)(相對(duì)表達(dá)量Sed組1，InF組為1.18± 0.13，Exe組為1.22±0.17)。

Fig. 7 Effects of intermittent fasting and exercise on relative expression of ULK1 in rats soleus muscle

2.5.3 間歇性禁食與有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)比目魚肌AMPKα、p-AMPKα(Thr172)蛋白表達(dá)的影響 干預(yù)14 d時(shí)，InF組、Exe組比目魚肌AMPKα、p-AMPKα(Thr172)蛋白水平較Sed組顯著增加，差異具有顯著性(P<0.05)，而InF組與Exe組之間未見顯著性差異(P>0.05)。干預(yù)28 d時(shí)，InF組、Exe組比目魚肌AMPKα、p-AMPKα(Thr172)蛋白仍維持在較高水平(圖8，表6)。

Fig. 8 Effects of intermittent fasting and exercise on relative expression of AMPKα and p-AMPKα(Thr172)in rats soleus muscle

Tab. 6 Effects of intermittent fasting and exercise on relative expressions of AMPKα and p-AMPKα(Thr172)in rats soleus muscle n=10)

3 討論

增加機(jī)體能量消耗和降低機(jī)體能量攝入是實(shí)現(xiàn)控制體重的兩種途徑，分別對(duì)應(yīng)著運(yùn)動(dòng)與飲食調(diào)控。運(yùn)動(dòng)對(duì)體重的控制作用已得到諸多證實(shí)[6]，本研究數(shù)據(jù)顯示，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著減緩大鼠體重與體脂增長(zhǎng)幅度，可能與自身熱量消耗增多、增加脂肪供能有關(guān)。飲食調(diào)控作為另一種體重控制手段，因其“不費(fèi)勁兒”、易堅(jiān)持等特點(diǎn)，逐漸得到人們的重視和喜愛，它不僅能有效控制機(jī)體體重及體脂含量[7-9]，還可以改善糖代謝能力，減輕氧化應(yīng)激，達(dá)到促進(jìn)健康、推遲衰老的效果。根據(jù)實(shí)施方案的不同，飲食調(diào)控手段可分為間歇性禁食、熱量限制、飲食限制三類。與熱量限制不同，間歇性禁食在攝食日不限制個(gè)體的飲食量，因此其依從性更好，此外，間歇性禁食在消耗脂肪方面也更為優(yōu)秀[10]。課題組前期研究顯示，對(duì)大鼠進(jìn)行4周小強(qiáng)度間歇性禁食干預(yù)(每周三、五禁食)可有效控制體重增長(zhǎng)，且未對(duì)骨骼肌質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[11]，因此本研究在前期研究基礎(chǔ)上加大飲食干預(yù)力度，并增加有氧運(yùn)動(dòng)組作為對(duì)比，為探索有效的減脂措施提供參考。本研究數(shù)據(jù)顯示，間歇性禁食組大鼠體重從第7日開始便明顯低于有氧運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組，體脂指數(shù)也在三組中表現(xiàn)最低，提示在減肥中采用飲食調(diào)控方法(如間歇性禁食)或許能較有氧運(yùn)動(dòng)收到更大的成效。

骨骼肌濕重及其單根肌纖維橫截面積受到合成代謝與分解代謝的調(diào)控，是體現(xiàn)肌肉適應(yīng)能力的間接標(biāo)準(zhǔn)。骨骼肌質(zhì)量(skeletal muscle mass)是肌纖維內(nèi)蛋白質(zhì)和水分的總稱，受肌肉蛋白合成(muscle protein synthesis，MPS)與肌肉蛋白降解(muscle protein breakdown，MPB)的雙向調(diào)控，適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可以增加骨骼肌質(zhì)量，而強(qiáng)度過大、持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)的不科學(xué)運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致MPB過程增強(qiáng)，降低骨骼肌質(zhì)量[12]。本研究采用有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)干預(yù)28 d時(shí)Exe組肌纖維橫截面積較Sed、InF組顯著增大(P<0.01)，說明本研究使用的有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度適宜，且該強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量有益改變的時(shí)間點(diǎn)可能是28 d。此外，目前有關(guān)飲食調(diào)控對(duì)骨骼肌質(zhì)量影響方面爭(zhēng)議較大，部分研究發(fā)現(xiàn)，熱量限制可以減少肌纖維的萎縮與損失[13,14]，防止肌肉力量丟失[15]；而有研究則認(rèn)為，飲食調(diào)控方法降低機(jī)體對(duì)糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入，對(duì)肌纖維蛋白合成及其質(zhì)量有負(fù)面效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)14 d、28 d時(shí)InF組肌纖維橫截面積及濕重指數(shù)較Sed組無明顯差異，而干預(yù)28 d時(shí)Sed及InF組肌纖維橫截面積均顯著低于Exe組(P<0.01)，說明本研究采用的飲食調(diào)控方法(即間歇性禁食)對(duì)骨骼肌質(zhì)量的作用僅是維持，若想提高骨骼肌質(zhì)量，需輔以適宜的運(yùn)動(dòng)。

機(jī)體利用自噬清除體內(nèi)“廢物”，通過包裹、運(yùn)送、水解等過程完成對(duì)被降解物的分解，該過程解除了體內(nèi)受損細(xì)胞器或蛋白質(zhì)對(duì)能量的消耗，使蛋白代謝及細(xì)胞環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，學(xué)術(shù)中常使用LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平反映自噬活性，其活性高低是左右骨骼肌質(zhì)量的關(guān)鍵，自噬水平過高使骨骼肌質(zhì)量受損，而自噬水平過低意味著體內(nèi)“廢物”的堆積，同樣對(duì)骨骼肌質(zhì)量不利[16,17]，因此適宜自噬活性是維持骨骼肌質(zhì)量的保證。禁食會(huì)引起自噬的激活，研究發(fā)現(xiàn)60%熱量限制可通過誘導(dǎo)小鼠骨骼肌Nix表達(dá)，促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生[18]。AMPK是誘導(dǎo)骨骼肌自噬的核心分子，可在Ser 317/Ser 555/Ser 467/Ser 637/Ser 777位點(diǎn)磷酸化ULK1，促進(jìn)ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物的形成，直接誘發(fā)自噬。研究表明，運(yùn)動(dòng)可通過激活A(yù)MPK途徑誘導(dǎo)骨骼肌自噬，基因敲除AMPK會(huì)降低機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力及線粒體功能[19,20]。而禁食由于能量攝入的減少，同樣對(duì)AMPK有激活作用。Bujak等[21](2015)發(fā)現(xiàn)，肌肉中的AMPK是饑餓過程中激活自噬的必需分子，敲除該蛋白會(huì)抑制自噬。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)14 d時(shí)，InF組比目魚肌AMPKα及其磷酸化、ULK1、LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)較Sed組顯著增加，p62水平顯著降低(P<0.05)；Exe組比目魚肌AMPKα及其磷酸化、ULK1蛋白水平顯著提高，但自噬標(biāo)志分子LC3與自噬底物p62表達(dá)水平在28 d才表現(xiàn)出顯著性變化(P<0.05)，提示14 d間歇性禁食干預(yù)可以通過打開“能量開關(guān)”AMPK，活化ULK1，使肌肉自噬發(fā)生，而該長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)雖能有效激活A(yù)MPK，但自噬體的形成與降解需更長(zhǎng)時(shí)間的干預(yù)。結(jié)合濕重、肌纖維橫截面積數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，14 d與28 d間歇性禁食誘導(dǎo)的骨骼肌自噬不會(huì)給骨骼肌質(zhì)量帶來負(fù)面影響，推測(cè)其原因可能是機(jī)體在能量攝入不足的情況下，會(huì)經(jīng)AMPK-ULK1途徑誘導(dǎo)適宜的骨骼肌自噬，降低體內(nèi)受損細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)對(duì)能量的消耗，以此適應(yīng)能量攝入的缺乏，從而維持骨骼肌質(zhì)量。

綜上所述，本研究采用的間歇性禁食方案(隔日禁食)在控制大鼠體重、體脂增長(zhǎng)方面優(yōu)于有氧運(yùn)動(dòng)。14 d間歇性禁食干預(yù)可經(jīng)AMPK/ULK1通路激活適宜自噬，以清除體內(nèi)受損細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，減少能量消耗，維持肌肉質(zhì)量，而有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)自噬的激活在28 d才更顯著，有關(guān)間歇性禁食作為一種“短期”的體重控制方式尚待進(jìn)行進(jìn)一步研究。

Fig. 9 Intermittent fasting induced skeletal muscle autophagy via AMPK-ULK1 pathway