黃顙魚寄生東肌吸蟲屬(復(fù)殖吸蟲亞綱:東肌吸蟲科)3種復(fù)殖吸蟲的分類學(xué)研究

李寄仟，李云臻，范麗仙，2*

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650500;2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明650500)

復(fù)殖吸蟲亞綱Digenea包括140多科1 000多屬(唐崇惕，唐仲璋，2015)，約18 000個(gè)物種，是最大的寄生蟲類群之一(Cribb et al.，2001)。Tubangui(1931)在菲律賓的胡鲇Clarias batrachus消化道中首次發(fā)現(xiàn)東肌吸蟲，并為其創(chuàng)立了東方肌體屬Orientocreadium Tubangui，1931，簡(jiǎn)稱東肌吸蟲屬，并將其隸屬于異肌科Allocreadiidae Stossich，1904，命名為O.batrachoides(擬柏他東肌吸蟲)，Tubangui(1933)又將此蟲置于異肌亞科Allocreadiinae Looss，1902。Pande(1934)補(bǔ)充了東肌吸蟲屬的一些特征，且將其歸屬于 Plesiocreadiinae Winfield，1929亞科。Bychowsky和Dubinina(1954)描述了新屬新種Paratormopsolus siluri，將其歸于棘體科Acanthocolpidae Lǔhe，1909，但據(jù)其形態(tài)特征，P.siluri屬于東肌吸蟲屬。Yamaguti(1958)在異肌科中創(chuàng)立了東肌亞科Orientocreadiinae Yamaguti，1958，將擬柏他東肌吸蟲及其他近似種編目在其中，他認(rèn)為下列各屬Ganada Chatterji，1933、Neoganada Dayal，1938、Nizamia Dayal，1938、Ganadatrema Dayal，1949 和 Paratormopsolus Bychowsky et Dubinina，1954均為東肌吸蟲屬的同物異名，除模式種擬柏他東肌吸蟲外，同時(shí)還對(duì)11種屬內(nèi)種進(jìn)行了描述;但Beverley-Burton(1962)曾報(bào)告擬柏他東肌吸蟲的形態(tài)變異范圍較大，認(rèn)為O.barabankiae、O.indicum、O.dayali、O.secundum、O.mohendrai、O.philippai以及 O.vermai等7種吸蟲均是擬柏他東肌吸蟲的同種異名。Skrjabin和Koval(1960)為本類吸蟲創(chuàng)立東肌吸蟲科Orientocreadiidae Skrjabin et Koval，1960新科。唐仲璋和林秀敏(1973)報(bào)告了擬柏他東肌吸蟲的生活史研究結(jié)果，并從幼蟲期發(fā)育史與其他科屬的親緣關(guān)系對(duì)其分類位置問題進(jìn)行了討論，認(rèn)為東肌吸蟲科應(yīng)是一個(gè)獨(dú)立的科，隸屬于斜睪總科Plagiorchioidea Dollfus，1930。Jones和 Bray(2008)認(rèn)為，東肌吸蟲科是一個(gè)單屬科，其下只有東肌吸蟲屬Orientocreadium Tubangui，1931，而原有的 Ganada Chatterji，1933、Neoganada Dayal，1938、Nizamia Dayal，1938、Ganadotrema Dayal，1949、Macrotrema Gupta，1951 nec Regan，1912 和 Paratormopsolus Bychowsky et Dubinina，1954均是東肌吸蟲屬的異名。Sokolov和Shchenkov(2017)、Dumbo等(2019)分別基于O.pseudobagri和擬柏他東肌吸蟲的分子數(shù)據(jù)，通過28S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了該家族的系統(tǒng)發(fā)育位置，均證明了東肌吸蟲科是一個(gè)獨(dú)立的分類單元，并隸屬于斜睪總科。

東肌吸蟲的成體通常寄生于非洲和歐亞大陸的淡水鲇形目Siluriformes和鱸形目Perciformes的消化道中，但也有些種類寄生在印度的陸生爬行動(dòng)物中(Beverley-Burton，1962;Yamaguti，1971;Hafeezullah，1989)。該類吸蟲目前已記錄28種，我國記錄3種:擬柏他東肌吸蟲、印度東肌吸蟲O.indicum Pande，1934和鯰東肌吸蟲O.siluri(Bycbowsky et Dubinina，1954)Yamaguti，1958(Yamaguti，1971;唐仲璋，林秀敏，1973;Wang et al.，1985;王溪云，1985;Hafeezullah，1989;Agrawal ＆ Sharma，1990;Shimazu，1990;Kim ＆ Rim，1995;Besprozvannykh et al.，2009;Nigam et al.，2015)。該屬一些物種的有效性存在爭(zhēng)議。

對(duì)于東肌吸蟲的分類研究，目前仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主，其主要的形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)為:體表具棘或光滑;子宮充滿了大部分的后體，環(huán)褶多或少;有一定區(qū)域分布的卵黃腺，具有內(nèi)外貯精囊和受精囊(Jones＆Bray，2008)。該類吸蟲的分子系統(tǒng)發(fā)育研究開始于 Sokolov和 Shchenkov(2017)提交的O.pseudobagri 28S rDNA序列，他們構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹確定了東肌吸蟲科的分類地位。之后，Dumbo等(2019)對(duì)擬柏他東肌吸蟲的18S、28S rDNA序列進(jìn)行了測(cè)序分析。

本研究通過形態(tài)分類學(xué)方法和分子系統(tǒng)學(xué)手段對(duì)采自云南瀾滄江水系黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco體內(nèi)的東肌吸蟲屬物種進(jìn)行了分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 宿主采集

黃顙魚采自云南省瀾滄江水系西雙版納傣族自治州景洪流域段(100°36'53″E，22°02'16″N，海拔576 m)和大理白族自治州洱海喜洲流域(100°17'30″E，25°87'27″N，海拔1 972 m)以及購自當(dāng)?shù)丶?，?6尾;寄生部位均位于宿主消化道末段(近泄殖孔)。

1.2 標(biāo)本處理及制作方法

將宿主魚處死，剪開腹腔，取出完整的消化道，用0.65% ～0.70%生理鹽水浸泡，并將其剖開置于解剖鏡(Olympus SZ)下檢查寄生蟲。發(fā)現(xiàn)蟲體后觀察活體，將其移至薄荷酒精中麻醉數(shù)分鐘至蟲體自然舒展后將蟲體進(jìn)行壓片，放入4%甲醛溶液浸泡12 h固定。將固定好的蟲體用70%乙醇溶液浸洗后置于Mayer's洋紅染液或硼砂洋紅染液中染色2～12 h，用70%酸酒精分色，至蟲體逐漸褪色到內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰為止。依次將蟲體置于70%、80%、90%、95%、100%和100%乙醇中梯度脫水(70% ～95%各1 h，100%各2 h)，置于透明液(二甲苯∶無水乙醇=1∶1)中透明1 h，再置于丁香油中透明過夜，然后取出蟲體用中性樹膠封片，平放晾干。將封片置于微分干涉差顯微鏡(Olympus BX53)下對(duì)蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、測(cè)量、拍照及繪圖。標(biāo)本保存于云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)教研室(正模標(biāo)本:201807JH105、副模標(biāo)本:201807JH101)。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育研究方法

將蟲體初步鑒定后浸泡于100%乙醇的1.5 mL的離心管中備用，使用D3399-01石蠟DNA提取試劑盒提取吸蟲的總DNA。PCR反應(yīng)體系為:2 × Power Taq PCR Master Mix(25 μL)、ddH2O(19 μL)、DNA 原液(2 μL)、上游引物(2 μL)、下游引物(2 μL)。引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成:上游引物L(fēng)SU-5(5'-TAGGTCGACCCGCTGAAYTTAAGCA-3')和下游引物1500R(5'-GCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3')(Sokolov＆Shchenkov，2017)。反應(yīng)條件:94℃ 1 min;92℃ 30 s，50℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 4 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。使用Chromas Pro V2和DNAMAN V6對(duì)序列進(jìn)行校正和拼接。采用MEGA 7.0比較分析各物種間的序列相似性和基于雙參數(shù)模型計(jì)算的遺傳距離(Kimura 2-parameter)(Thompson et al.，1997)?；?28S rDNA部分序列，采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法、最大似然 (Maximum Likelihood，ML)法和最大簡(jiǎn)約(Maximum Parsimony，MP)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 鑒定結(jié)果

復(fù)殖吸蟲亞綱Digenea van Beneden，1858

前口目Prosostomata Odhner，1905

斜睪總科Plagiorchioidea Dollfus，1930

東肌吸蟲科Orientocreadiidae Skrjabin et Koval，1960

東肌吸蟲屬Orientocreadium Tubangui，1931

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

東肌吸蟲科隸屬于吸蟲綱Trematoda Rudolphi，1808復(fù)殖吸蟲亞綱前口目斜睪總科。東肌吸蟲科蟲體伸長，體表具棘(有的光滑)，口吸盤亞端位，具前咽，咽較大，食道短，兩腸管到達(dá)體后端。腹吸盤位于體前端約1/3處，或距前端稍遠(yuǎn)，個(gè)別位于體赤道線部位。兩睪丸團(tuán)塊狀，前后或斜列于體后半部。陰莖囊棒狀，含內(nèi)貯精囊、前列腺和陰莖。具有外貯精囊。生殖孔位居中于腹吸盤直接前方，陰莖囊延伸到腹吸盤的后方。卵巢在腹吸盤和前睪丸之間。子宮延伸到體后端，越過兩腸支外側(cè)。蟲卵小而數(shù)多，具卵殼。卵黃腺分布在體后部?jī)蓚?cè)，常到達(dá)體末端附近，由卵黃濾泡組成，呈近圓形或不規(guī)則團(tuán)塊狀。排泄囊管狀，前伸到后睪丸。成蟲通常寄生于非洲和歐亞大陸的淡水鲇形目和鱸形目魚類的消化道中，也有一些種類寄生在印度的陸生爬行動(dòng)物中(Jones＆Bray，2008)。東肌吸蟲科目前被認(rèn)為是一個(gè)單屬科(Sokolov＆Shchenkov，2017)，科下僅有東肌吸蟲屬。本研究共記述3種(新種、地理新記錄種及已記錄種各1種)。

東肌吸蟲屬蟲體體表具棘，有的光滑，子宮充滿了大部分的后體，卵黃腺分布在一定區(qū)域，具有內(nèi)外貯精囊和子宮精囊。屬內(nèi)種鑒定特征主要為:蟲體大小、體表具體棘或光滑、口腹吸盤大小比較、卵黃腺分布水平、卵黃管細(xì)胞形態(tài)、子宮環(huán)褶多或少，蟲體末端尖銳或圓鈍等。東肌吸蟲屬目前共記錄有效種約28種(Sokolov＆ Shchenkov，2017)，我國已記錄其中3種(唐仲璋，林秀敏，1973;王溪云，1985)。模式種:擬柏他東肌吸蟲。

3種東肌吸蟲屬口吸盤亞頂端位，略小于腹吸盤。咽球形，具4個(gè)肌質(zhì)前突。食道較短。陰莖囊與腹吸盤重疊，向右側(cè)彎曲，從生殖孔延伸至腹吸盤后方。外貯精囊向陰莖囊右后方折疊，位于腹吸盤與卵巢之間。卵巢近圓形，光滑，位居中于腹吸盤與前睪丸之間。睪丸近圓形，光滑，居中位，前后排列于蟲體的后部，前睪丸略小于后睪丸。卵黃腺分布在卵巢前緣至后睪丸之后水平。子宮末段發(fā)育良好，肌質(zhì)，位于陰莖囊左側(cè)，內(nèi)壁具棘(圖1～圖3)。

2.1.1 黃顙東肌吸蟲，新種Orientocreadium fulvidraconis sp.nov.(圖1)

宿主:黃顙魚。

寄生部位:腸道。

采集地點(diǎn):瀾滄江水系云南西雙版納景洪流域段(100°79'53″E，22°00'78″N，海拔 576 m)。

采集時(shí)間:2018年7月。

感染率:16.7%(1/6)。

感染強(qiáng)度:每尾魚感染1～45枚蟲體。

詞源:以宿主命名。

正模標(biāo)本:201807JH105、副模標(biāo)本:201807JH101均存放于云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

對(duì)正模和5個(gè)副模進(jìn)行形態(tài)特征數(shù)據(jù)測(cè)量，度量單位mm，正模標(biāo)本蟲體全形見圖1。蟲體末端稍圓鈍，體長為 2.42(2.08～2.98)，寬為 0.42(0.35～0.51)。體表無棘?？谖P大小為0.17(0.16～0.20)×0.15(0.11～0.18)。腹吸盤位于蟲體前1/3處，大小為0.19(0.17～0.21)×0.18(0.15～0.20)?？诟刮P比為1∶1.35(1.15～1.55)。前咽長0.15(0.10～0.19)，咽大小為0.12(0.10～0.13)×0.10(0.08～0.12)。食道長0.08(0.05～0.14)。陰莖囊大小為 0.34(0.28～0.46)×0.11(0.09～0.13)，內(nèi)貯精囊大小為0.06(0.05～0.07)×0.05(0.04～0.05)。外貯精囊大小為0.22(0.20～0.25)×0.12(0.11～0.14)。卵巢位于蟲體1/2處，大小為0.15(0.13～0.19)×0.13(0.11～0.15)。前睪丸大小為0.20(0.16～0.23)×0.16(0.13～0.19)，后睪丸大小為0.22(0.18～0.25)×0.18(0.14～0.21)。子宮環(huán)褶較少，子宮末段大小為0.26(0.22～0.34)×0.05(0.04～0.07)。卵大小為0.033(0.030～0.038)×0.020(0.016～0.026)。

經(jīng)以上形態(tài)學(xué)特征和測(cè)量數(shù)據(jù)的比較，該種吸蟲與寄生于印度胡鲇消化道內(nèi)的O.lucknowensis Nigam，2015(Nigam et al.，2015)和寄生于日本叉尾瘋鲿Tachysurus nudiceps和石鯰Silurus lithophilus消化道內(nèi)的O.pseudobagri Yamaguti，1934(Shimazu，2014)相似度較高。雖然 O.lucknowensis體表也無體棘，但其蟲體較短，前咽缺失，卵黃腺從卵巢前緣水平分布至蟲體末端等;O.pseudobagri體表具體棘，卵黃管細(xì)胞呈“晶格”狀等。二者的這些特征均明顯區(qū)別于新種。綜合以上形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為，該種吸蟲為東肌吸蟲屬一新種，以終末宿主名命名為黃顙東肌吸蟲新種O.fulvidraconis sp.nov(表1;圖1)。

2.1.2 Orientocreadium pseudobagri

宿主:黃顙魚。

寄生部位:腸道。

采集地點(diǎn):瀾滄江水系云南西雙版納景洪流域段(100°79'53″E，22°00'78″N，海拔 576 m)。

采集時(shí)間:2018年7月。

感染率:33.3%(2/6)。

圖1 黃顙東肌吸蟲新種Orientocreadium fulvidraconis sp.nov.Fig.1 Orientocreadium fulvidraconis sp.nov.

感染強(qiáng)度:每尾魚感染2～8枚蟲體。

對(duì)正模和4個(gè)副模進(jìn)行形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量，度量單位mm，正模標(biāo)本蟲體全形見圖2。該吸蟲體末端稍圓鈍，體長為2.19(1.57～3.03)，寬為0.41(0.30～0.53)。體表具棘，前端較為密集，向后分布逐漸變稀疏，至后睪丸后緣處消失。口吸盤大小為0.16(0.14～0.20)×0.16(0.13～0.19)。腹吸盤位于蟲體前1/3處，大小為0.19(0.16～0.24)×0.18(0.13～0.22)?？诟刮P比為 1∶1.32(1.10～1.65)。前咽長0.12(0.05～0.20)，咽大小為0.11(0.09～0.13)×0.11(0.09～0.13)。食道長0.08(0.07～0.10)。陰莖囊大小為 0.33(0.27～0.45)×0.09(0.07～0.12)，內(nèi)貯精囊大小為0.08(0.07～0.12)×0.06(0.05～0.07)。外貯精囊大小為0.15(0.11～0.19)×0.09(0.06～0.10)。卵巢位于蟲體1/2處，大小為0.16(0.13～0.21)×0.15(0.12～0.20)。前睪丸大小為0.19(0.15～0.25)×0.17(0.13～0.21)，后睪丸大小為0.21(0.16～0.29)×0.18(0.13～0.25)。兩側(cè)的輸卵黃小管由晶格狀細(xì)胞組成。子宮環(huán)褶較少，子宮末段大小為0.24(0.20～0.32)×0.05(0.03～0.06)。卵大小為0.031(0.027～0.037)×0.019(0.016～0.023)。

經(jīng)以上形態(tài)學(xué)特征和測(cè)量數(shù)據(jù)的比較，該種吸蟲與寄生于日本 P.surantiacus消化道內(nèi)的O.pseudobagri Yamaguti，1934(Shimazu，2014)、寄生于日本叉尾瘋鲿和石鯰消化道內(nèi)的O.pseudobagri Yamaguti，1934(Shimazu，2014)和寄生于朝鮮黃顙魚消化道內(nèi)的O.pseudobagri Kim and Rim，1995(Kim＆Rim，1995)的形態(tài)特征相一致。故認(rèn)為該種吸蟲為記錄種O.pseudobagri，中國首次記錄(表1;圖2)。

圖2 Orientocreadium pseudobagriFig.2 Orientocreadium pseudobagri

2.1.3 印度東肌吸蟲Orientocreadium indicum

宿主:黃顙魚。

寄生部位:腸道。

采集地點(diǎn):瀾滄江水系云南大理洱海喜洲流域段(100°17'29″E，25°87'26″N，海拔 1 972 m)。

采集時(shí)間:2019年6月。

感染率:40%(4/10)。

感染強(qiáng)度:每尾魚感染8～34枚蟲體。

對(duì)正模和14個(gè)副模進(jìn)行形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量，度量單位mm，正模標(biāo)本蟲體全形見圖3。該吸蟲體末端稍尖，體長為1.43(1.13～1.88)，寬為0.29(0.23～0.37)。體表具棘，前端較為密集，向后分布逐漸變稀疏，至后睪丸后緣處消失。口吸盤大小為0.13(0.10～0.14)×0.12(0.09～0.13)。腹吸盤位于蟲體前1/4或1/5處，大小為0.14(0.11～0.16)×0.13(0.10～0.15)。前咽長0.06(0.03～0.10)，咽大小為 0.10(0.07～0.12)×0.07(0.06～0.08)。食道長0.04(0.03～0.06)。陰莖囊大小為 0.31(0.24～0.35)×0.06(0.05～0.08)，內(nèi)貯精囊大小為0.05(0.04～0.07)×0.04(0.03～0.05)。外貯精囊大小為0.12(0.08～0.18)×0.05(0.04～0.07)。卵巢位于蟲體前1/3或1/2處，大小為0.12(0.10～0.14)×0.09(0.08～0.11)。前睪丸大小為0.16(0.12～0.19)×0.12(0.09～0.15)，后睪丸大小為0.17(0.12～0.19)×0.14(0.10～0.17)。子宮環(huán)褶較多，子宮末段大小為0.17(0.11～0.22)×0.03(0.02～0.05)。卵大小為0.033(0.027～0.038)×0.019(0.014～0.023)。

經(jīng)以上形態(tài)學(xué)特征和測(cè)量數(shù)據(jù)的比較，該種吸蟲與寄生于我國黃顙魚消化道內(nèi)的印度東肌吸蟲O.indicum Wang，1985(王溪云，周靜儀，1993)的形態(tài)特征相一致。故認(rèn)為該種吸蟲為印度東肌吸蟲(表1;圖3)。

2.2 中國東肌吸蟲屬物種檢索表

a.體表具棘 ………………………………………………b

體表無棘…………………………………………………… 黃顙東肌吸蟲Orientocreadium fulvidraconis sp.nov.

b.口吸盤小于腹吸盤，卵黃腺從卵巢前緣水平分布至后睪丸后方 …………………………………………………c口吸盤大于腹吸盤，卵黃腺從卵巢前緣水平分布至蟲體末端 ………………… 擬柏他東肌吸蟲O.batrachoides

c.腹吸盤位于蟲體前1/3，子宮環(huán)褶少，體棘由前體分布至后睪丸后部水平 ………………………………………d腹吸盤位于蟲體前1/5，子宮環(huán)褶多，體棘由前體分布至后睪丸水平 ………………… 印度東肌吸蟲O.indicum

d.蟲體較長，前咽較短，卵黃管細(xì)胞非“晶格”狀……………………………………………… 鯰東肌吸蟲O.siluri蟲體較短，前咽較長，卵黃管細(xì)胞呈“晶格”狀………………………………………………………O.pseudobagri

2.3 基于28S rDNA序列東肌吸蟲屬的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究

本研究首次測(cè)序得到黃顙東肌吸蟲(MK325223)、O.pseudobagri(MK325224)和印度東肌吸蟲(MN369022)的28S rDNA部分序列，長度分別為924 bp、922 bp和923 bp。對(duì)黃顙東肌吸蟲的序列進(jìn)行了堿基組分分析(BLAST)，將從Gen-Bank中選取的18條28S rDNA部分序列(包括本研究的序列)對(duì)齊后長度為935 bp，其中保守位點(diǎn)692個(gè)、變異位點(diǎn)241個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)162個(gè)、自裔位點(diǎn)79個(gè)。T、A、C、G堿基的平均含量為27.3%、21.4%、20.6%、30.6%，A+T 的含量低于C+G。18條序列來自斜睪總科的5個(gè)科(Macroderoididae、Auridistomidae、Orientocreadiidae、Leptophallidae、Alloglossidiiae)(表 2)。該新種與 Gen-Bank中目前僅有的4條東肌吸蟲屬復(fù)殖吸蟲的同源性序列相似度比較結(jié)果顯示，序列相似度在95.96% ～99.57%之間，其中與印度東肌吸蟲(本研究)的最高，為99.57%，與O.pseudobagri(俄羅斯)的為99.35%，與O.pseudobagri(本研究)的為99.13%，與擬柏他東肌吸蟲(南非)的最低，為95.96%?；?8S rDNA部分序列雙參數(shù)模型計(jì)算的遺傳距離為0.004～0.124，黃顙東肌吸蟲新種序列與東肌吸蟲科的其他4條序列之間的遺傳距離為0.004～0.036，與印度東肌吸蟲的遺傳距離最近(0.004)，與O.pseudobagri(本研究)和 O.pseudobagri(俄羅斯)的遺傳距離均為0.006(表3)。以Macroderoididae+ Auridistomidae［Paramacroderoides echinus(MH041375)、Paramacroderoides kinsellai(HM137664)、Auridistomum chelydrae(AY116872)］作為外群，采用NJ法、ML法和MP法構(gòu)建了以NJ樹為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的50%多數(shù)一致樹(圖4)，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，東肌吸蟲科為一個(gè)獨(dú)立的分類單元并支持與Leptophallidae為姊妹群聚為一支。黃顙東肌吸蟲新種與印度東肌吸蟲聚為姐妹群。

圖3 印度東肌吸蟲Orientocreadium indicumFig.3 Orientocreadium indicum

3 討論

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圖4 基于28S rDNA部分序列，以鄰接法、最大似然法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的NJ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)50%多數(shù)一致樹Fig.4 The rooted condensed tree of NJ/ML/MP analysis based on NJ tree topology constructed from 28S rDNA partial sequence

本研究結(jié)果支持Jones和Bray(2008)的形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)，并認(rèn)同唐仲璋和林秀敏(1973)的觀點(diǎn)，獲得的3種東肌吸蟲屬物種隸屬于斜睪總科中的東肌吸蟲科。黃顙東肌吸蟲蟲體伸長，體表無棘，卵黃腺分布在卵巢前緣至后睪丸之后水平等，明顯區(qū)別于屬內(nèi)其他物種，雖然O.lucknowensis體表也無棘，但其蟲體較短，前咽缺失，卵黃腺從卵巢前緣水平分布至蟲體末端等特征明顯將二者區(qū)分。此外，O.pseudobagri卵黃腺內(nèi)側(cè)的輸卵黃小管由晶格狀細(xì)胞組成，匯合到卵黃總管，而在其他2種中不明顯。Jones和Bray(2008)認(rèn)為具晶格狀細(xì)胞的輸卵黃小管存在于未成熟的東肌吸蟲屬物種中。但在O.pseudobagri成體和未成熟蟲體中均明顯存在此晶格狀細(xì)胞，而在其他2種的成體和未成熟蟲體中均未發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞。據(jù)此，本研究認(rèn)為晶格狀卵黃管細(xì)胞的存在與蟲體成熟程度無關(guān)，且可作為屬內(nèi)種鑒定依據(jù)。

由于目前GenBank中對(duì)于東肌吸蟲科的分子數(shù)據(jù)較少，國內(nèi)外的很多學(xué)者對(duì)其分類地位及系統(tǒng)發(fā)育方面的研究大多僅限于對(duì)其生活史和形態(tài)特征的研究。本研究首次獲得了東肌吸蟲屬3種吸蟲的28S rDNA部分序列，構(gòu)建了斜睪總科5科9屬17種吸蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示 Orientocreadiidae與 Leptophallidae為姊妹群，2類吸蟲存在密切的親緣關(guān)系。Dayal(1938)最早注意到Orientocreadiidae在形態(tài)學(xué)上與Leptophallidae非常相似，它們之間密切的親緣關(guān)系受其生活史中的共源性狀所支持，如成蟲均存在1個(gè)外貯精囊且子宮末段發(fā)達(dá);尾蚴在子胞蚴體中形成囊蚴，排泄囊袋狀等(Kim ＆ Rim，1995;Tkach，2008)。Orientocreadiidae+Leptophallidae與Alloglossidiidae聚為一支，它們的成蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)相似度較高，體現(xiàn)在蟲體伸長，具咽，食道較短，陰莖囊發(fā)達(dá)，卵巢1個(gè)，睪丸2個(gè)，卵黃腺分布在蟲體兩側(cè)，子宮內(nèi)卵小且多，通常充滿大部分后體，排泄囊Ⅰ型等特征，但Orientocreadiidae+Leptophallidae與Alloglossidiidae在生活史中沒有共源性狀，Alloglossidiidae的成蟲不具外貯精囊且子宮末段不發(fā)達(dá)，幼蟲為具眼點(diǎn)的單尾型尾蚴Ophthalmoxiphidio cercariae，排泄囊“Y”型，尾蚴在雷蚴體內(nèi)發(fā)育等(Crawford，1937;Sirikantayakul，1985)，推測(cè)二者間也存在較密切的親緣關(guān)系。

本研究獲得的黃顙東肌吸蟲以高自舉值在東肌吸蟲科進(jìn)化支中單獨(dú)聚在了進(jìn)化支的頂部，厘定了形態(tài)學(xué)的鑒定結(jié)果，同時(shí)可推測(cè)黃顙東肌吸蟲可能是出現(xiàn)較晚的物種且與印度東肌吸蟲親緣關(guān)系近。同時(shí)在Sokolov和Shchenkov(2017)的研究基礎(chǔ)上增加了東肌吸蟲科的分子數(shù)據(jù)量，得到了一致的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系:東肌吸蟲科為斜睪總科中一個(gè)獨(dú)立的分類單元。

致謝:感謝云南省西雙版納環(huán)境監(jiān)測(cè)站的王建軍老師、云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的徐偉江老師在魚類標(biāo)本采集中給予的幫助。