四川省鄰水縣發(fā)現(xiàn)武陵洞蛭

任伯凇，黃太福，伍麗艷，袁小玥，劉志霄*

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000;2.湖南壺瓶山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，湖南石門415000)

山蛭俗稱山螞蟥，主要生活在熱帶和亞熱帶的叢林和草叢中，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門Annelida蛭綱Hirudinea山蛭科Haemadipsidae(楊潼，1996)。全球現(xiàn)已知該科4屬2組，其中3顎蛭組3屬，2顎蛭組1屬。分布于中國境內(nèi)的是3顎蛭組的山蛭屬Haemadipsa、三顎四環(huán)蛭屬Tritetrabdella和中國洞蛭 屬 Sinospelaeobdella(Apakupakul et al.，1999;Trontelj ＆ Utevsky，2005;Borda et al.，2008;Lai et al.，2011;Tessler et al.，2016;Huang et al.，2019)。

中國洞蛭屬由Huang等(2019)建立，目前僅記錄2種，分別為洞穴山蛭S.cavatuses和武陵洞蛭S.wulingensis，均為真洞穴動(dòng)物。前者分布于云南南部和西部邊境(楊潼等，2009;郭云膠等，2010)，后者發(fā)現(xiàn)于湖南湘西州永順縣、古丈縣和吉首市境內(nèi)的幾個(gè)溶洞中。最近在四川省廣安市鄰水縣進(jìn)行調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)并采集了2條洞蛭標(biāo)本。綜合形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)，將其鑒定為武陵洞蛭Sinospelaeobdella wulingensis，為四川省洞穴陸生蛭類的首次分布記錄。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用樣本共計(jì)2條(編號:20190408-1，20190408-2)，2019年4月張濤等人在四川省廣安市鄰水縣老龍洞(106°51'48.77″E，30°21'16.57″N，海拔895 m)發(fā)現(xiàn)并采集。標(biāo)本均用95%乙醇固定保存于吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院動(dòng)物標(biāo)本室。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)觀察 依據(jù)蛭類測量方法(楊潼，1996;丁魯民，2004;Lai et al.，2011)，使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測量標(biāo)本的外形(體長、頭寬、最大體寬和尾吸盤徑長)，并用體視顯微鏡(Motic-SMZ168)進(jìn)行解剖觀察。

1.2.2 DNA的提取、擴(kuò)增與測序 取標(biāo)本的部分尾吸盤組織放入100%乙醇中，用1%濃度的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗2次之后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(B518251)完成整個(gè)DNA的提取過程。提取成功后，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA模板，并于－20℃保存?zhèn)溆?。線粒體COⅠ基因序列采用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198進(jìn)行擴(kuò)增(Folmer et al.，1994;Guan ＆ Gao，2008)。PCR反應(yīng)體系總體積 50 μL:0.5 μL 模板、5 μL 10 ×PCR Buffer、4 μL 25 mmol· L－1dNTP、0.5 μL 10 μmol·L－1引物、0.5 μL Taq 酶、ddH2O 補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，49℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次;72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司純化后測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行拼接。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測序結(jié)果用Chromas 2.33查看峰值，利用DNAstar 7.1對拼接序列進(jìn)行編輯校正。選用MEGA 5.0基于Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter)計(jì)算全部堿基替換情形下的序列間遺傳距離并統(tǒng)計(jì)堿基組成、信息位點(diǎn)、保守位點(diǎn)等(Kimura，1981)。以最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化樹各分支的置信度采用1 000次自檢分析進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

四川(洞蛭)標(biāo)本(表1)體型中等，前1/3段體小而細(xì)，白色或微紅色，體后2/3明顯較前段寬大，呈紅褐色(乙醇浸泡后的標(biāo)本呈米白色)，但皮膚表面本身缺乏色素且背面各環(huán)上具乳突和背部感受器，腹面不明顯。身體可見27體節(jié)共94環(huán)，完全體節(jié)的環(huán)數(shù)為5環(huán);雌、雄生殖孔分別位于33/34(Ⅻ:b2/a2)、35/36(Ⅻ:b5/b6)環(huán)的腹中環(huán)溝上間隔2環(huán)?？谖P口孔較大，邊緣呈瓣?duì)睿蓄€3枚。尾吸盤近圓形且較大，徑長(4.63/5.30)超過最大體寬，背面也有乳突。眼點(diǎn)5對，第2對眼最大、第5對眼仍然存在(圖1)。背部乳突較小。

圖1 四川洞蛭標(biāo)本的外形特征Fig.1 The external morphological characteristics of Sichuan cave-dwelling leech specimens

2.2 分子鑒定

有效獲得了線粒體COⅠ基因序列681 bp，NCBI Blast程序檢測顯示，與武陵洞蛭相似度最高達(dá)到95.74%，與洞穴山蛭的相似度為90.14%。在COⅠ序列中含有保守位點(diǎn)558個(gè)，變異位點(diǎn)95個(gè)，信息位點(diǎn)71個(gè)。基于線粒體COⅠ基因使用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，四川標(biāo)本和武陵洞蛭關(guān)系更為接近(圖2)。雙參數(shù)模型計(jì)算的遺傳距離顯示，四川標(biāo)本與武陵洞蛭相差4.5%，與洞穴山蛭相差10%。

表1 武陵洞蛭和洞穴山蛭形態(tài)特征比較Table 1 The morphological traits of Sinospelaeobdella wulingensis and S.cavatuses

圖2 基于線粒體COⅠ基因構(gòu)建的最大似然樹Fig.2 Maximum Likelihood(ML)tree based on sequences of mitochondrial COⅠgene

表2 基于COⅠ基因計(jì)算的中國洞蛭屬種內(nèi)及種間的遺傳距離Table 2 The uncorrected pairwise genetic distance in the Sinocavebdella based on COⅠgene analysis

3 討論

此次采集的四川標(biāo)本具顎3枚，生殖孔間隔2環(huán)，第2對眼最大，第5對眼仍然存在，體背部的乳突較小等結(jié)構(gòu)特征與武陵洞蛭相同而異于洞穴山蛭。且體長、頭寬、最大體寬和尾吸盤徑長等測量值也與武陵洞蛭相符。同時(shí)，分子數(shù)據(jù)顯示其親緣關(guān)系更接近于武陵洞蛭。遺傳距離也顯示，四川標(biāo)本和洞穴山蛭差異大(10%)而與武陵洞蛭差異較小(4.5%)。綜合形態(tài)學(xué)與分子數(shù)據(jù)，暫將四川標(biāo)本鑒定為武陵洞蛭。然而，四川標(biāo)本與武陵洞蛭間的差異，特別是遺傳距離達(dá)到4.5%，究竟是種內(nèi)交流阻隔所致，還是已達(dá)到亞種或新種的分化水平，仍有待采集更多標(biāo)本并采取多基因乃至基因組綜合性的深入研究予以厘清。

致謝:感謝四川小寨子溝國家級自然保護(hù)區(qū)管理局張濤、四川省鄰水縣自然資源和規(guī)劃局萬峰山森林公園梁國平在標(biāo)本采集方面給予的幫助;感謝吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院彭清忠教授和黃興龍博士在分子數(shù)據(jù)方面的鼎力支持與幫助。