中藥巖黃連總堿的體外抗菌實驗研究＊

丘倩倩，韋志鵬，吳麗敏，劉怡雯，蒙田秀

中藥巖黃連總堿的體外抗菌實驗研究＊

丘倩倩，韋志鵬，吳麗敏，劉怡雯，蒙田秀

（廣西中醫(yī)藥大學(xué) 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222）

通過體外培養(yǎng)革蘭氏陽性菌和陰性菌，用中藥巖黃連總堿進(jìn)行抑菌和殺菌實驗，測定藥物的最小抑菌藥物濃度（MIC）和最小殺菌藥物濃度（MBC），觀察培養(yǎng)條件對MIC的影響，考察巖黃連總生物堿的體外抗菌作用。結(jié)果顯示，巖黃連總堿對常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，其中9種菌株有殺菌作用，除銅綠假單胞菌和白色假絲酵母菌外，同時改變培養(yǎng)液的pH和細(xì)菌接種量，不影響測定結(jié)果。實驗表明，巖黃連總生物堿有很好的體外抗菌作用。

巖黃連；總生物堿；體外抗菌；實驗研究

巖黃連（Corydalis saxicola Bunting）來源于罌粟殼紫堇屬植物，是廣西特色藥材，由于藥效近似黃連又長在石縫中或巖石上而得名，因此又叫土黃連、巖連等[1]。巖黃連味苦，性涼，有散瘀消腫、清熱利濕功效，臨床可用于治療肝硬化、肝炎、肝腫瘤及作為輔助治療[2-3]。其主要生長在廣西、貴州、四川、云南等地方，廣西主要分布在桂西、桂西等地[4]。目前已研制了注射液和片劑等中成藥制劑，是臨床治療肝硬化、肝炎、肝癌等特效藥[5-7]。近些年來，國內(nèi)國外對巖黃連研究較多，其化學(xué)成分復(fù)雜，已報道有57種化學(xué)成分，主要是49個生物堿類及8個甾體類成分，并進(jìn)行了多方面巖黃連相關(guān)藥效作用研究?，F(xiàn)代藥理研究證明，巖黃連具有抗肝炎病毒、保肝、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、鎮(zhèn)靜及其他藥理作用[8]。探索中藥抗菌藥效的方法有體內(nèi)試驗和體外試驗兩大方法，前期對抗菌中藥的研究，多在體外進(jìn)行。體外抗菌實驗是第一步，本項目先從體外抗菌實驗展開，研究中藥巖黃連總生物堿的抗菌作用，為今后的進(jìn)一步研究做鋪墊。

1 試藥與材料

1.1 試藥

巖黃連藥材購于廣西玉林中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏副教授鑒定為罌粟殼紫堇屬巖黃連。巖黃連總生物堿的提取：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取時間為2 h，合并提取液，濾過，備用。

1.2 試劑

所用實驗試劑：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂。

1.3 儀器

所用實驗儀器：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、BKQ-B59L壓力蒸汽滅菌器（山東博科科學(xué)儀器有限公司）、DH-500恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、10～200 μL微量移液器、0.22 μL一次性無菌超微濾器、一次性無菌培養(yǎng)皿。

1.4 材料

所用實驗材料：革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、糞鏈球菌）、革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、變形桿菌、白色假絲酵母菌）

2 方法

MIC和MBC測定：將革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、糞鏈球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、變形桿菌、白色假絲酵母菌）37 ℃、24 h培養(yǎng)，再將上述菌株接種在營養(yǎng)肉湯，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、24 h培養(yǎng)。細(xì)菌計數(shù)用比濁法進(jìn)行，再用肉湯配制為 106 CFU/mL的菌液備用。用肉湯由10%為起點對巖黃連總堿肉湯藥液進(jìn)行連續(xù)二倍梯度稀釋，逐次加入0.2 mL/孔于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再按0.01 mL/孔單獨加入濃度為 106 CFU/mL的每種試驗菌菌液，且分細(xì)菌和培養(yǎng)基對照孔。先在4 ℃環(huán)境中培養(yǎng)12 h，再于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、培養(yǎng) 48 h，直接肉眼觀察結(jié)果。若無細(xì)菌生長（不渾濁）孔的最小藥物濃度為MIC。再用無菌蒸餾水依次將各沒有細(xì)菌生長孔的培養(yǎng)物稀釋10倍，吸取0.01 mL接種在普通瓊脂平板上，于普通培養(yǎng)箱37 ℃、培養(yǎng)48 h，以接種區(qū)域無細(xì)菌生長所對應(yīng)的最小藥物濃度為MBC。

培養(yǎng)條件對MIC測定的影響：用表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌，將含有巖黃連總堿肉湯培養(yǎng)液的pH分別調(diào)整到5.7、7.2、8.2，將試驗菌液濃度一次調(diào)到104 CFU/mL、106 CFU/mL、108 CFU/mL，測定MIC。

3 結(jié)果

巖黃連總堿對常見的9種革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，同時，除白色假絲酵母菌和銅綠假單胞菌，對其他9種菌株有殺菌作用，如表1所示。

巖黃連總堿對6種340株腸道感染的臨床分離菌株有一定的殺菌作用，如表2所示。改變培養(yǎng)液條件（pH和細(xì)菌接種量），不影響測定結(jié)果。

4 討論

中藥自古以來在感染性疾病的防治中發(fā)揮了積極的作用，為保障人類的健康起到重大貢獻(xiàn)。近年來，許多研究者對中藥抗菌作用進(jìn)行了大量的實驗研究，發(fā)現(xiàn)很多中草藥和許多方劑對某些病原菌具有良好的抗菌作用，并將這些中藥或其有效成分制成了制劑[9-12]，用于臨床防治傳感染性疾病，推動了醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。本實驗通過測定中藥巖黃連生物堿的體外抗菌作用，發(fā)現(xiàn)其具有良好的廣譜抗菌活性，這給巖黃連生物堿開發(fā)為廣譜抗菌劑提供理論基礎(chǔ)，同時也為中藥抗菌藥物的開發(fā)拓寬新渠道。

表1 巖黃連總堿對常見革蘭氏陽性菌和陰性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC（單位：mg/mL）

菌株MICMBC 金黃色葡萄球菌17.870.0 化膿性鏈球菌20.570.0 糞鏈球菌17.870.0 大腸埃希菌35.570.0 銅綠假單胞菌70.0＞300.0 福氏志賀菌16.835.5 傷寒沙門菌35.570.0 腸炎沙門菌16.870.0 肺炎克雷伯菌70.0130.0 變形桿菌70.0130.0 白色假絲酵母菌130.0＞300.0

表2 巖黃連總堿對340株臨床分離細(xì)菌的MIC、MBC（單位：mg/mL）

菌種菌株MIC范圍MIC50MIC90MBC范圍 大腸埃希菌13016.8～70.035.57035.5～130.0 傷寒沙門菌288.4～70.035.57016.8～130.0 腸炎沙門菌2516.8～130.035.513016.8～300.0 福氏志賀菌228.4～70.016.835.516.8～70.0 肺炎克雷伯菌8035.5～300.070300130.0～300.0 變形桿菌5516.8～130.07013035.5～300.0

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［2］貴州中醫(yī)藥研究院.貴州草藥［M］.貴陽：貴州人民出版社，1970：609-610.

［3］廣西衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)［M］.南寧：廣西科技出版社，1990：223-224.

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R284

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.09.015

2095－6835（2020）09－0043－02

2018年廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：201813643024）

丘倩倩（1997—），女，廣西來賓人，本科。

蒙田秀（1985—），女，廣西桂林人，碩士，高級實驗師，研究方向為中藥藥效學(xué)研究。

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕