線粒體缺氧性損傷及其法醫(yī)學(xué)意義

胡毅愷，張恒，肖碧，陳龍

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083）

機械性窒息是指機械性暴力作用引起呼吸障礙所導(dǎo)致的窒息，其案發(fā)率僅次于機械性損傷，在我國暴力案件中排名第二[1]。目前機械性窒息的法醫(yī)學(xué)鑒定主要依靠縊痕、勒痕和一些非特異性的尸體征象（顏面水腫、器官淤血等），面對現(xiàn)場遭到破壞的復(fù)雜案例往往因缺乏特異性標志物而難以完成精準鑒定。線粒體對于缺氧環(huán)境極為敏感，其損傷標志物或可作為診斷機械性窒息的依據(jù)，本文將闡述線粒體（mitochondrion）在缺氧環(huán)境中發(fā)生的特異性變化，并探討其運用于法醫(yī)學(xué)實踐的可能性。

1 線粒體

線粒體是真核細胞中一種獨特的細胞器，具有多形性、易變性、運動性和適應(yīng)性等特點。線粒體的主要功能是通過氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），為細胞活動提供能量。正常成年人經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生的能量占其機體產(chǎn)生總能量的80%以上[2]。據(jù)報道，機體所攝入的氧氣約90%在線粒體中被利用，其中2%經(jīng)線粒體內(nèi)膜電子傳遞系統(tǒng)（electron transfer system，ETS）產(chǎn)生氧自由基[3]，過量的氧自由基對細胞具有毒性作用[4]。缺氧時，ETS及氧化磷酸化途徑發(fā)生障礙，ETS中酶活性受到抑制，ATP合成受阻，產(chǎn)生過量氧自由基，使得線粒體受到損傷，進而導(dǎo)致細胞受損[5-6]。近年來，越來越多的學(xué)者開始研究機體缺氧情況下線粒體的損傷及其機制。

2 缺氧狀態(tài)與機械性窒息

缺氧是指組織氧供減少或不能充分利用氧導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的過程，人體組織中正常氧分壓水平約為3.2～8.8kPa（24～66mmHg），各組織對于缺氧的耐受性存在較大差異，神經(jīng)細胞、心肌細胞等對缺氧較為敏感，而骨骼肌細胞、胃腸道平滑肌細胞及精細胞等對缺氧的耐受性較好。當組織含氧量低于正常水平時，機體即進入缺氧狀態(tài)。根據(jù)不同的病理生理機制，缺氧可細分為低張性缺氧、血液性缺氧、循環(huán)性缺氧及組織性缺氧等[7]。

機械性窒息是指機械性暴力引起呼吸障礙所導(dǎo)致的窒息，根據(jù)暴力的作用方式，可分為縊死、勒死、扼死、壓迫胸腹部所致窒息、捂死、悶死及梗死等多種形式。目前已有學(xué)者嘗試通過檢測死后血液pH值變化、血氣分析[8]、血液離子濃度改變[9]、缺氧相關(guān)蛋白表達水平[10]、mRNA及miRNA標志物水平[11-12]等諸多方法以推斷機械性窒息死亡。

機械性窒息的本質(zhì)是缺氧引起的中樞神經(jīng)功能障礙、呼吸和循環(huán)功能衰竭[13]，且持續(xù)時間往往較短，一般在數(shù)分鐘內(nèi)即可致人死亡。而在急性缺氧情況下，大量氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)氧化反應(yīng)、Ca2+超載、氧化磷酸化受抑制等一系列變化，都可以造成線粒體的損傷，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為線粒體腫脹、脊斷裂溶解、外膜破裂和基質(zhì)外溢等[14]。

3 線粒體損傷在缺氧中的研究進展

3.1 缺氧引起線粒體膜電位的降低

在缺氧環(huán)境下，機體線粒體膜電位的降低是受損的表現(xiàn)之一[15]，目前認為其機制主要與線粒體解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCP）活性的上調(diào)和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放相關(guān)。

由氧化磷酸化解偶聯(lián)引起的能量合成下降以及耗氧效率降低，被認為是線粒體受損的最主要特征[16]。UCP是線粒體載體蛋白家族的一個亞族，定位于線粒體內(nèi)膜，可將線粒體內(nèi)膜外的H+轉(zhuǎn)運至基質(zhì)，降低線粒體的跨膜質(zhì)子電動勢[17]。MURRAY等[18]發(fā)現(xiàn)在慢性心衰模型的大鼠心肌細胞中UCP3的表達量增加了53%，而其磷氧比值（adenosine diphosphateoxygen ratio，ADP/O）相比于對照組則明顯降低。研究[19]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過抑制腦缺血大鼠UCP2的表達達到提高線粒體ADP/O的作用，進而減輕缺氧缺血性損傷對腦組織的損害。以上研究表明，UCP的活性增強并引起線粒體膜電位的降低是缺氧環(huán)境下線粒體損傷的重要表現(xiàn)之一。

mPTP開放的增強是導(dǎo)致線粒體膜電位降低的另一個主要因素[20]。在缺氧環(huán)境下，細胞膜表面的Na+-K+-ATP酶難以正常工作，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+外流以及谷氨酸受體啟動增加等因素都可以導(dǎo)致細胞基質(zhì)內(nèi)Ca2+數(shù)量上升，造成細胞基質(zhì)內(nèi)鈣超載，可能導(dǎo)致細胞mPTP開放[21]，mPTP的開放可引起線粒體膜電位的下降，最終致ATP的耗竭[22]。

3.2 缺氧造成線粒體自噬

自噬是機體對物質(zhì)進行循環(huán)利用并修正自身錯誤的機制之一，線粒體自噬是指機體自身在精密調(diào)控下通過溶酶體清除線粒體的過程[23]。低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)機體發(fā)生線粒體自噬，這一過程主要與Bcl-2/E1B-19000相互作用蛋白3（Bcl-2/E1B 19000-interacting protein 3，Bnip3）和 Bcl-2/E1B-19 000相互作用3樣（Bnip3-like，Bnip3L）蛋白通路的激活相關(guān)，Bnip3及其同系物Bnip3L的N端含有一個WXXL樣的基序，在其與自噬相關(guān)蛋白8（autophagy-related protein 8，ATG8）的結(jié)合中作用，而Bnip3蛋白與ATG8的結(jié)合有助于線粒體與自噬體的對接，促進自噬的發(fā)生[24]。此外，該通路激活可競爭性地將Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1或Bcl-XL-Beclin-1復(fù)合物中游離出來，游離狀態(tài)的Beclin-1可以參與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PIK3）復(fù)合體，該復(fù)合體可以調(diào)節(jié)多種Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而激活自噬的發(fā)生[25]。目前發(fā)現(xiàn)，Bnip3及Bnip3L途徑的激活主要受到缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）和線粒體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影響[26]。

研究顯示，在機體缺氧條件下，HIF對于細胞代謝，血管再生，血細胞生成，細胞增殖、分化及凋亡等過程起著重要的調(diào)節(jié)作用[27]。HIF-1由對氧分壓敏感的α亞基和對氧分壓不敏感的β亞基構(gòu)成[28]，在缺氧條件下，HIF-1α降解途徑受阻，進入細胞核與HIF-1β合成HIF-1[29]。HIF-1可以激活Bnip3通路以及Bnip3L通路，從而促進線粒體自噬的發(fā)生。此外，在缺氧環(huán)境下，線粒體內(nèi)大量ROS生成。ROS能夠激活HIF-2α，并增加Bnip3的表達，以此促進線粒體自噬的發(fā)生[30]。另外，ROS對于核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）也有激活作用，Nrf2因子可以誘導(dǎo)p62蛋白的表達，p62可以與輕鏈3（light chain 3，LC3）相互作用以促進線粒體自噬的發(fā)生[31]，也有研究[32-34]指出，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）因子的激活、PTEN誘導(dǎo)激酶（PTEN-induced putative kinase，PINK）的激活及線粒體內(nèi)腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）的堆積等因素均對低氧環(huán)境下線粒體的自噬有促進作用。

3.3 缺氧導(dǎo)致線粒體分裂

在細胞面臨代謝或環(huán)境應(yīng)激時，線粒體融合與分裂的平衡對細胞功能的維系有重要意義，其中，線粒體的分裂可以產(chǎn)生新的線粒體。在應(yīng)激條件下促進移除受損的線粒體以維持線粒體的質(zhì)量[35]。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，線粒體的分裂主要由胞質(zhì)動力蛋白家族成員線粒體發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）和線粒體分裂 1（mitochondrial fission 1，F(xiàn)is1）蛋白共同介導(dǎo)。

缺氧作為一種強烈的應(yīng)激源可以誘發(fā)細胞內(nèi)線粒體的分裂[36]。有學(xué)者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細胞線粒體的分裂[37]。有報道[38]指出，當缺氧導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載時，胞質(zhì)中的Ca2+可激活鈣調(diào)磷酸酶，使DRP1（S637）去磷酸化，導(dǎo)致其從細胞質(zhì)基質(zhì)中聚集到線粒體外膜，促進線粒體分裂。此外，也有學(xué)者[39]指出，大量ROS可以促使DRP1（S616）磷酸化水平升高，進而活化DRP1，促進線粒體的分裂。

目前，學(xué)界普遍認為適度的線粒體分裂有助于清除受損的線粒體，但過度的線粒體分裂可能會導(dǎo)致細胞的死亡[40]，其具體意義及機制尚待進一步研究。

3.4 缺氧誘導(dǎo)經(jīng)線粒體途徑的細胞凋亡發(fā)生

缺氧窒息可以誘導(dǎo)線粒體途徑的細胞凋亡，在生理條件下，促凋亡因子［Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Bcl-2同源拮抗劑（Bcl-2 homologous antagonist/killers，Bak）等］與抗凋亡因子［B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、B細胞淋巴瘤-XL（B cell lymphoma-XL，Bcl-XL）等］結(jié)合，不具有凋亡活性。當細胞受到外界強烈刺激時，激活BH3-only蛋白（Bcl-2 homology-3 domain only protein），競爭性抑制促凋亡因子與抗凋亡因子的結(jié)合，游離的促凋亡因子可以在線粒體外膜上形成蛋白通道，促使細胞色素C（cytochrome C）及第二線粒體源性半胱天冬酶激活劑（second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC）釋放進入細胞質(zhì)。而后細胞色素C介導(dǎo)caspase-9的激活，SMAC則封閉X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）對caspase的抑制作用，最終導(dǎo)致細胞的凋亡[41]。還有學(xué)者[42]發(fā)現(xiàn)，位于線粒體的Bax/Bak除可以介導(dǎo)細胞色素C的釋放外，還可以調(diào)控線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)因子的核轉(zhuǎn)運，從而進一步促進細胞凋亡的發(fā)生。

已有研究[43]發(fā)現(xiàn)，在新生兒發(fā)生缺氧缺血后，Bax從Bcl-2及Bcl-XL上釋放，并向線粒體轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致細胞凋亡。國內(nèi)也有學(xué)者[44]對肺泡上皮細胞在缺氧后受到的損傷進行了研究，發(fā)現(xiàn)肺上皮細胞在缺氧環(huán)境下也會誘發(fā)凋亡的發(fā)生。另有學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因小鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)當XIAP表達量上升時，缺氧缺血對其大腦的損傷作用有所減輕[45]，這也從側(cè)面印證了缺氧環(huán)境確實可以通過線粒體途徑誘發(fā)細胞的凋亡。

4 線粒體損傷在機械性窒息死因鑒定中的法醫(yī)學(xué)意義

法醫(yī)學(xué)實踐中對窒息死亡的案例通常根據(jù)死者顏面部發(fā)紺、內(nèi)部器官淤血、“玫瑰齒”、上腔靜脈回流綜合征、Tardieu氏斑、尸斑彌漫暗紫紅色以及頸部索痕、扼痕、呼吸道堵塞等尸體征象，在排除其他死因后，結(jié)合現(xiàn)場及案情分析方能給出“符合性”診斷。在面對案情不明、現(xiàn)場破壞或尸體征象不明顯（如使用柔軟物體覆蓋口鼻）的情況下，對于機械性窒息的診斷就極為困難[46]。

線粒體是機體內(nèi)消耗氧氣并產(chǎn)生能量的重要細胞器，其對于缺氧的發(fā)生極為敏感，當機體面臨缺氧環(huán)境時，線粒體可以出現(xiàn)包括形態(tài)改變、膜電位下降、自噬、線粒體蛋白滲入胞質(zhì)及分裂等多種變化。在其他死因中，機體細胞在機體死亡后尚可利用機體血液中殘存的氧氣進行一定程度上的呼吸，緩慢走向細胞死亡，細胞所經(jīng)歷的過程是一個慢性缺氧的過程。而在機械性窒息發(fā)生時，機體在短時間內(nèi)發(fā)生劇烈的缺氧，細胞經(jīng)歷的是短時間內(nèi)急性缺氧的過程，對缺氧敏感的細胞（心、腦組織等）其線粒體有可能出現(xiàn)特征性的變化，這種變化如果能夠被法醫(yī)病理學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)，將成為機械性窒息診斷的重要依據(jù)，且由于線粒體對于缺氧的敏感性，這些指標可以在案情不明或現(xiàn)場遭到破壞等情況下給案件的偵查提供有價值的方向性線索。

目前，法醫(yī)學(xué)實踐對線粒體的運用主要是將線粒體的DNA測序應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)實踐[47]，而線粒體缺氧指標有望作為組織經(jīng)歷缺氧窒息的證據(jù)，成為鑒定機械性窒息的輔助指標之一?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)對于線粒體缺氧條件下的研究多著眼于細胞在慢性缺氧或缺血-再灌注情況下其線粒體發(fā)生的變化[48-50]，也有許多研究著眼于腫瘤細胞中線粒體的特征性病理生理學(xué)改變[51-52]，涉及細胞急性缺氧死亡或集體窒息死亡后線粒體變化的研究較少。

5 展 望

線粒體是人體內(nèi)與氧氣消耗直接相關(guān)的細胞器，對缺氧極為敏感。但是目前對于線粒體的研究尚不完善，尤其是對于其運用于法醫(yī)病理學(xué)實踐的可能性的研究較少。

運用線粒體相關(guān)指標進行死因推斷的難點主要在于：（1）線粒體易降解，對于保存的要求較高；（2）線粒體的提取較為復(fù)雜，對實驗人員及實驗室有一定的要求；（3）目前尚無成熟的可以運用于法醫(yī)病理學(xué)實踐的線粒體損傷標志物。針對以上問題，我們認為可以采取以下措施予以解決：（1）通過動物實驗，探索線粒體的降解規(guī)律，劃定可以運用線粒體損傷標志物的死亡時間范圍；（2）探究更為完善的線粒體提取及檢測技術(shù)，使線粒體損傷標志物可應(yīng)用的死亡時間范圍更為廣泛；（3）進行動物實驗，利用蛋白質(zhì)譜技術(shù)，尋找在不同死亡原因中表達有所差異的蛋白質(zhì)，圍繞所發(fā)現(xiàn)的蛋白探索其相關(guān)通路上可以用作死因推斷的指標，并在此基礎(chǔ)上利用免疫印跡法、免疫熒光技術(shù)、實時熒光定量核酸擴增檢測等相關(guān)技術(shù)對所發(fā)現(xiàn)的指標在動物實驗樣本及實際檢案人體樣本上進行驗證，以期發(fā)現(xiàn)可以用作機械性窒息死因推斷的線粒體相關(guān)指標。

隨著對于線粒體損傷的研究逐漸加深，其標志物或有助于在某些情況下判定死因是否為機械性窒息，將成為法醫(yī)病理學(xué)診斷中的一個重要補充。