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    RAP1A和EPAC1在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義*

    2020-11-28 08:19:32沈利聰板得瑩張瑜
    關(guān)鍵詞:異位癥異位卵巢

    沈利聰,板得瑩,張瑜

    (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 婦科,湖南 長(zhǎng)沙410008)

    子宮內(nèi)膜異位癥是最常見(jiàn)的婦科慢性疾病之一,育齡期婦女發(fā)病率為10%~15%[1]。子宮內(nèi)膜異位癥主要引起疼痛、不孕和盆腔包塊,70%~93%青少年期女性痛經(jīng)因其引起,而15%~50%的女性不孕癥是由其導(dǎo)致[2]。據(jù)中國(guó)婦科疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示,子宮內(nèi)膜異位癥的疾病負(fù)擔(dān)為婦科疾病的第3 位[3]。子宮內(nèi)膜異位癥是良性疾病,卻具有惡性腫瘤的一些特性,如侵襲性、復(fù)發(fā)性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,約有1%患者可能惡變,被稱(chēng)為“良性腫瘤”[4]。但目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

    多種假說(shuō)如經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、干細(xì)胞學(xué)說(shuō)、細(xì)胞增殖與凋亡失衡等從不同角度闡釋可能引起子宮內(nèi)膜異位癥的病因及發(fā)病機(jī)制,然而,沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能完全解釋其內(nèi)在機(jī)制[1,5],表明子宮內(nèi)膜異位癥是一種多因素、多種機(jī)制參與導(dǎo)致的慢性疾病。RAS 相關(guān)蛋白1(Ras-associated protein 1, RAP1)是RAS 小G 蛋白家族中的一員,通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1由2 種異構(gòu)體組成,即RAP1A 和RAP1B。研究發(fā)現(xiàn),RAP1A 在肝癌、胰腺癌、食管癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達(dá),通過(guò)參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡失衡等多種生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-11]。環(huán)磷酸腺苷交換蛋白1(the exchange protein directly activated by cAMP1, EPAC1)是一種非蛋白激酶A 依賴(lài)的信號(hào)分子,是環(huán)磷酸腺苷cAMP 的下游效應(yīng)分子。EPAC1 參與GDP/GTP 交換,將RAP1 結(jié)合的鳥(niǎo)苷二磷酸置換為鳥(niǎo)苷三磷酸,引起RAP1 激活。EPAC1/RAP1 通路參與細(xì)胞增殖、分化、黏附等多種生物學(xué)功能[12-14]。然而,RAP1A 和EPAC1 在子宮內(nèi)膜異位癥的作用尚無(wú)研究報(bào)道。

    本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法及Western blotting 法檢測(cè)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥及正常子宮內(nèi)膜的表達(dá),并探討兩者的相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    2019年6月—2020年1月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦科因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔鏡手術(shù)患者18 例,年齡22 ~45 歲,平均(32.72±4.95)歲;取異位及在位內(nèi)膜組織各18 份。取15 例卵巢單純性囊腫或畸胎瘤(鏡下未見(jiàn)卵巢及盆腔內(nèi)膜異位病灶)患者的子宮正常內(nèi)膜組織作為對(duì)照,年齡20 ~43 歲,平均(30.28±4.41)歲。所有組織經(jīng)甲醛固定、脫水后石蠟包埋。所有研究對(duì)象均為月經(jīng)周期規(guī)律的育齡期婦女,根據(jù)末次月經(jīng)及病理檢查證實(shí)所有內(nèi)膜組織均為增生期,術(shù)前3 個(gè)月未接受任何激素治療,術(shù)后病理檢查證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥或子宮正常內(nèi)膜。根據(jù)r-AFS 分期標(biāo)準(zhǔn),卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者均為Ⅲ、Ⅳ期。各組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)執(zhí)行(#201910255)。

    1.2 試劑及儀器

    兔抗人RAP1A 單克隆抗體(MA1-103)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司,兔抗人EPAC1 單克隆抗體(ab109415)購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司,免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠,掃描儀購(gòu)自愛(ài)普生(中國(guó))有限公司,顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司,轉(zhuǎn)膜儀、圖像分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

    1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

    石蠟包埋的組織標(biāo)本進(jìn)行4 μm 連續(xù)切片,將切片置于65℃恒溫箱烤片30 min,接著予松節(jié)油脫蠟、梯度酒精水化。切片經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)15 min,3%過(guò)氧化氫室溫孵育20 min 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,牛血清白蛋白封閉20 min,一抗孵育(RAP1A 按1 ∶200 稀釋?zhuān)珽PAC1 按1 ∶100 稀釋?zhuān)幮詫?duì)照用PBS 代替一抗)4℃冰箱過(guò)夜,37℃復(fù)溫45 min,清洗后加入二抗室溫孵育1 h。最后,經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片后,倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

    每張切片計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍鏡視野(×40),染色結(jié)果判讀采用免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS),分別記錄染色強(qiáng)度(SI)和陽(yáng)性細(xì)胞百分比(PP)。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒,每次閱片時(shí)需保證白平衡、亮度等參數(shù)設(shè)置一致。根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)弱將染色強(qiáng)度分為4 個(gè)等級(jí):0 分為陰性,1 分為弱陽(yáng)性,2 分為中度陽(yáng)性,3 分為強(qiáng)陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為5 個(gè)等級(jí):0 分,<5%;1 分,5% ~25%;2 分,>25% ~50%;3 分,>50%~75%;4 分,>75%。最后計(jì)算IRS 值,IRS=SI×PP,獲得組織染色半定量評(píng)分。IRS 為0 ~12 分,IRS ≤3 分定義為低表達(dá),IRS>3 分定義為高表達(dá)。

    1.4 Western blotting 檢測(cè)

    組織剪碎后加入RIPA 裂解液,置于冰上裂解,離心后提取總蛋白;用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度;將蛋白溶液按照4 ∶1 的比例加入5×蛋白上樣緩沖液,沸水浴變性;取50 μg 總蛋白行SDSPAGE 電泳;恒壓100 V 轉(zhuǎn)膜1 h;5%脫脂牛奶封閉1 h;1 ∶1 000 稀釋RAP1A 一抗,1 ∶1 000 稀釋EPAC1 一抗,1 ∶1 000 稀釋GAPDH 一抗,4℃孵育過(guò)夜;在室溫下用TBST 洗膜3 次,加入1 ∶3 000稀釋的二抗,于搖床上室溫孵育1.5 h;用TBST 洗膜3 次,加入ECL 溶液進(jìn)行顯色反應(yīng),曝光,最后顯影和定影。保存圖片并用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);相關(guān)性分析用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組內(nèi)膜RAP1A 的表達(dá)

    RAP1A 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜,在在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示,異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為(5.688±0.651)分、(8.700±1.144)分、(0.787±0.053)分,3 組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.005,P=0.009);異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜的IRS 水平均高于正常內(nèi)膜(P<0.05);異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2)。

    2.2 各組內(nèi)膜EPAC1 的表達(dá)

    圖1 RAP1A 在各組內(nèi)膜的表達(dá) (免疫組織化學(xué)×40)

    圖2 RAP1A 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 (±s)

    EPAC1 在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá),在間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有表達(dá);其在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜,在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖3)。免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示,異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為(8.100±1.153)分、(8.878±1.829)分、(2.520±0.138)分,3 組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.850,P=0.002);異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜(P<0.05);異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

    2.3 各組內(nèi)膜RAP1A 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

    RAP1A 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.518±0.059)、(0.479±0.381)、(0.177±0.012),3 組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.664,P=0.006);異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜(P<0.05);異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

    2.4 各組內(nèi)膜EPAC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

    EPAC1 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.813±0.067)、(0.829±0.052)及(0.228±0.041),3 組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.069,P=0.005);異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜(P<0.05);異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

    圖3 EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達(dá) (免疫組織化學(xué)×40)

    圖4 EPAC1 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 (±s)

    圖5 各組內(nèi)膜中RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)

    2.5 RAP1A 和EPAC1 表達(dá)的相關(guān)性

    采用Pearson 法對(duì)RAP1A 和EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達(dá)分別進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)在異位內(nèi)膜(r=0.635,P=0.033)和在位內(nèi)膜(r=0.697,P=0.005)及正常內(nèi)膜(r=0.436,P=0.018)均呈正相關(guān)。

    3 討論

    子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見(jiàn)病,在育齡期長(zhǎng)期處于活躍狀態(tài),由于發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前臨床尚缺乏針對(duì)性的、長(zhǎng)期有效的生物治療手段。尋找在子宮內(nèi)膜異位癥差異表達(dá)的分子,探索可能的治療生物靶點(diǎn),具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)升高,表明其可能參與疾病的發(fā)病過(guò)程。

    RAP1A 通過(guò)調(diào)控多種分子信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1A 通過(guò)激活ERK/MAPK/Notch 信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。RAP1A 基因多態(tài)性導(dǎo)致肝移植后肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高[6]。LI 等[9]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RAP1A 可通過(guò)激活A(yù)kt 信號(hào)通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺激細(xì)胞遷移和侵襲,從而促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)RAP1A 在結(jié)直腸癌高表達(dá),并揭示其通過(guò)激活PTEN/FOXO3/CCND1 通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲。劉立果[16]發(fā)現(xiàn)RAP1A 可通過(guò)PTEN/FOXO3/CCND1信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展,并通過(guò)臨床回顧分析發(fā)現(xiàn)RAP1A 可作為結(jié)直腸癌患者總體生存的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),在前列腺癌細(xì)胞敲除RAP1A 后,癌細(xì)胞的增殖、黏附和侵襲能力下降[17]。上述研究表明,RAP1A在細(xì)胞增殖、侵襲、黏附等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),RAP1A 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)高于正常內(nèi)膜,提示RAP1A 可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義,可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的細(xì)胞增殖、侵襲、黏附等過(guò)程。有趣的是,孫樹(shù)凱等[18]發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)損傷小鼠的RAP1A 表達(dá)升高,機(jī)械痛閾明顯降低,而脊髓組織分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬標(biāo)志分子表達(dá)及自噬水平均升高,表明RAP1A 高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展,該過(guò)程可能與RAP1A 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此,筆者推測(cè),RAP1A 在子宮內(nèi)膜異位癥高表達(dá),不僅參與疾病的發(fā)生過(guò)程,還可能通過(guò)自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生過(guò)程,后續(xù)進(jìn)一步研究RAP1A 及自噬在子宮內(nèi)膜異位癥的作用將可能揭示發(fā)生痛經(jīng)的新機(jī)制。

    EPAC1 是細(xì)胞內(nèi)一種非依賴(lài)PKA 的介導(dǎo)cAMP 效應(yīng)的重要分子,在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮核心作用[19-20]。EPAC1 可活化鳥(niǎo)苷三磷酸酶,促進(jìn)RAP1A 結(jié)合鳥(niǎo)苷三磷酸變成活化形式。EPAC1基因缺失在體外抑制微血管形成,在病理性血管生成的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。EPAC1-RAP1A-NHE3通路可能調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥發(fā)生[21]。在結(jié)直腸癌中,EPAC1 呈高表達(dá),且對(duì)評(píng)估患者預(yù)后具有重要價(jià)值[22]。近年來(lái),多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)EPAC1 激活可能引起痛覺(jué)受體過(guò)敏,從而導(dǎo)致機(jī)體疼痛發(fā)生[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn),EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)高于正常內(nèi)膜,推測(cè)其可能通過(guò)促進(jìn)腹腔子宮內(nèi)膜異位癥病灶新生微血管生成參與子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn),EPAC1 與RAP1A 的表達(dá)呈正相關(guān),推測(cè)兩者可能相互協(xié)同,共同促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、侵襲和黏附過(guò)程。最近研究表明[25],炎癥在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,EPAC1 高表達(dá)也可能通過(guò)促進(jìn)炎癥過(guò)程而參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展。子宮內(nèi)膜異位癥引起疼痛的確切機(jī)制尚不清楚,RAP1A 及EPAC1兩者高表達(dá),可能協(xié)同參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的慢性疼痛。

    在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制研究中,“經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)”是最早被廣泛接受的學(xué)說(shuō),活性的子宮在位內(nèi)膜通過(guò)輸卵管逆流到腹腔,在腹腔環(huán)境下,需經(jīng)過(guò)黏附、侵襲和血管形成才能在腹膜或卵巢等盆腹腔形成異位病灶。在該過(guò)程中,在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)特征起重要作用,決定了異位內(nèi)膜的生物學(xué)行為,這就是郎景和院士提出的經(jīng)典的“在位內(nèi)膜決定論”[26]。本研究中,異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明兩者在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的表達(dá)均具有相似的特征,進(jìn)一步證實(shí)在位內(nèi)膜是子宮內(nèi)膜異位癥的根源,符合“在位內(nèi)膜決定論”學(xué)說(shuō)。由此可見(jiàn),RAP1A 和EPAC1 可能成為子宮內(nèi)膜異位癥潛在的分子診斷和治療靶點(diǎn)。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中高表達(dá),且兩者的表達(dá)呈正相關(guān),推測(cè)RAP1A 和EPAC1 可能相互協(xié)同,參與疾病的發(fā)生、發(fā)展及痛經(jīng)的調(diào)控過(guò)程。EPAC1 表達(dá)升高,可能加速置換鳥(niǎo)苷三磷酸,促進(jìn)RAP1A 激活,進(jìn)而增強(qiáng)在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附及新生微血管形成能力,還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究為進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制及探索可能的治療新靶點(diǎn)提供了思路。

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