水鹽脅迫下棉花葉片光合的氣孔與非氣孔限制

Mounkaila Hamani Abdoul Kader ，申孝軍，陳津賽 ，王廣帥，高 陽(yáng)*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)田灌溉研究所，河南 新鄉(xiāng)453002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京100081）

0 引 言

【研究意義】光合作用是植物利用光能固定大氣中的CO2合成有機(jī)物的過(guò)程，但其常受生物和非生物脅迫的抑制[1]。干旱和鹽脅迫是我國(guó)西北干旱高鹽區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物—棉花遭受的主要非生物脅迫，嚴(yán)重制約了棉花的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)。因此，研究水鹽脅迫對(duì)棉花葉片光合的影響，對(duì)于揭示棉花的抗逆機(jī)制、確保棉花高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)都具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值?！狙芯窟M(jìn)展】植物的光合作用對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)十分敏感，通常情況下，干旱程度越高，植物光合速率越低；然而，不同植物的生理和生態(tài)特性對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)也不盡相同[2]。Casson 等[3]認(rèn)為氣孔調(diào)節(jié)是植物抵御干旱脅迫和適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制之一。植物通過(guò)控制氣孔的開(kāi)閉程度和密度來(lái)調(diào)節(jié)葉片的蒸騰與光合速率，且不同植物的氣孔在應(yīng)對(duì)不同程度干旱時(shí)表現(xiàn)不同[4]。鹽脅迫對(duì)植物光合過(guò)程的影響非常復(fù)雜，已有研究表明鹽脅迫抑制植物葉片光合過(guò)程主要包括氣孔限制和非氣孔限制2 個(gè)方面[5-8]。自Grassi 等[9]提出量化光合限制分析方法后，常被用于植物光合限制因子分析。Tosens 等[10]與Wang 等[11]指出氣孔限制和葉肉限制是干旱脅迫影響植物光合的主要因子，而江曉慧等[12]認(rèn)為隨鹽分量的增加，光合限制因素由葉肉因素轉(zhuǎn)變?yōu)楣夂蠙C(jī)構(gòu)受損?！厩腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于水鹽脅迫抑制植物葉片光合速率主要由氣孔限制還是非氣孔限制仍沒(méi)有形成統(tǒng)一的結(jié)論，也有研究認(rèn)為是氣孔因子和非氣孔因子共同作用的結(jié)果?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，基于Grassi 等提出光合抑制因子量化方法，研究水鹽脅迫對(duì)棉花葉片光合速率的影響，量化不同光合抑制因子對(duì)棉花光合速率的貢獻(xiàn)?？蔀榻沂局参锕夂线^(guò)程對(duì)水鹽脅迫的響應(yīng)及其環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供參考，也可為植物耐逆緩減技術(shù)創(chuàng)建提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年3—6 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院七里營(yíng)綜合試驗(yàn)基地的人工氣候室進(jìn)行（35.09°N，113.48°E）。以‘新陸中37’為供試棉花品種。對(duì)籽粒飽滿(mǎn)且大小均勻的棉花種子進(jìn)行消毒處理后，將種子播撒于裝有900 g 細(xì)沙（直徑0.5～0.8 mm）的PVC 桶（直徑6 cm，高40 cm）內(nèi)，每個(gè)桶澆水200 mL。人工氣候室的溫度設(shè)為25 ℃/20 ℃，濕度為40%～50%，光照時(shí)長(zhǎng)為12 h（08:00—20:00），植株上方的光量子通量為600 μmol/（m2·s）。種子萌發(fā)后，每3～5 d 澆水50 mL 以保證水分充足，幼苗生長(zhǎng)至1 葉期時(shí)，開(kāi)始澆Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液5 d 澆1 次，每次100 mL，以保證棉花處于水分充足狀態(tài)。Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的配方為1 180 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、506 mg/L KNO3、136 mg/L KH2PO4、693 mg/L MgSO4。幼苗生長(zhǎng)到3 片真葉時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行水鹽脅迫處理。試驗(yàn)共設(shè)4 個(gè)處理：T1 為對(duì)照，無(wú)水分和鹽分脅迫；T2 為水分脅迫，灌水量為T(mén)1 的60%；即T1 處理每5 d 澆營(yíng)養(yǎng)液100 mL，T2 處理每5 d 澆營(yíng)養(yǎng)液60 mL。T3 為鹽分脅迫，T4 為水鹽脅迫處理；鹽溶液的NaCl 物質(zhì)的量濃度為150 mmol/L，T3 處理每5 d 澆無(wú)鹽營(yíng)養(yǎng)液40 mL 與含鹽營(yíng)養(yǎng)液60 mL，而T4 處理每5 d 只澆含鹽營(yíng)養(yǎng)液60 mL。脅迫18 d 后，選取最新完全展開(kāi)葉進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 葉片光合速率與響應(yīng)曲線(xiàn)測(cè)定

采用Li-6400XT 便攜式光合測(cè)定儀觀(guān)測(cè)棉花葉片的光合參數(shù)，測(cè)定的光強(qiáng)固定為1 200 μmol/（m2·s），CO2摩爾分?jǐn)?shù)固定為400 μmol/mol，每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定CO2響應(yīng)曲線(xiàn)時(shí)，葉室的光強(qiáng)設(shè)為1 000 μmol/（m2·s），CO2梯度設(shè)為400、300、200、100、50、400、400、600、800、1 000、1 200、1 600、1 800和2 000 μmol/mol；測(cè)定光響應(yīng)曲線(xiàn)時(shí)，CO2摩爾分?jǐn)?shù)設(shè)為400 μmol/mol，光強(qiáng)梯度設(shè)為1 800、1 600、1 500、1 400、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20 和0 μmol/（m2·s）。

1.3 葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

使用MINI-PAM 熒光儀測(cè)定相同葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。采用暗適應(yīng)夾對(duì)葉片進(jìn)行暗適應(yīng)處理30 min，測(cè)定棉花葉片最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、光化學(xué)猝滅、非光化學(xué)猝滅、PSII 的最大光化學(xué)效率等參數(shù)。測(cè)定熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)時(shí)，將葉片用暗適應(yīng)夾具進(jìn)行暗處理20 min 以上，設(shè)置光化光照時(shí)間和熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)延遲時(shí)間，光化光強(qiáng)設(shè)置為 420 μmol/mol，然后測(cè)量熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

1.4 葉片氣孔特征、葉水勢(shì)與色素量測(cè)定

將棉花葉片上表皮撕取下后，去掉葉肉組織，制成玻片。在OLYMPUS顯微鏡40倍目鏡下觀(guān)察拍照，采用ImageJ1.4.8 軟件進(jìn)行處理分析。采用WP4C 露點(diǎn)水勢(shì)儀測(cè)定棉花葉片的葉水勢(shì)。光合和熒光測(cè)定結(jié)束后，采集各處理的葉片樣品，參照Lichtenthaler等[13]的方法進(jìn)行葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素量的測(cè)定，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

光合系統(tǒng)II 的光化學(xué)效率（ΦPSII）由式（1）計(jì)算得出：

式中：Fm′和FS分別為最大熒光和穩(wěn)態(tài)熒光。

電子傳遞速率（Jf）計(jì)算式為：

式中：PPFD 為葉片上方的光強(qiáng)，1 000 μmol/（m2·s）；α 為葉片吸收系數(shù)；β 表示吸收的光量子在光合系統(tǒng)I 和II 間的分配。α 和β 分別取值為0.84 和0.5[14-15]。

采用變量J 法計(jì)算葉肉導(dǎo)度（gm）[16]：

式中：Ci為胞間CO2濃度（μmol/（m2·s））；Γ*為葉綠體CO2摩爾分?jǐn)?shù)補(bǔ)償點(diǎn)（μmol/（m2·s），Rd為光照下線(xiàn)粒體呼吸，即暗呼吸速率（μmol/（m2·s）。Γ*計(jì)算式為：

式中：C 為常數(shù)，25 ℃時(shí)取值12.7；ΔHα 為活化能（KJ/mol），25 ℃時(shí)取值23.2；R 為摩爾氣體常數(shù)（KJ/ （Kmol）），25 ℃時(shí)取值8.314[17]。TK為絕對(duì)溫度（K）。

采用FvCB 模型計(jì)算棉花葉片光合速率[18]，光合速率的氣孔限制（Is）、葉肉限制（Im）和生化特征限制（Ib）計(jì)算式為[9]：

式中：KC和KO分別為CO2和O2的米氏常數(shù)；Vcmax為最大羧化速率（mmol/（m2·s））；O 為氧氣物質(zhì)的量濃度（210 mmol/mol）。

用Photosynthesis 軟件和光合助手[19]處理葉片光合數(shù)據(jù)以及響應(yīng)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)，利用Origin 2017 作圖，SPSS 21 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 多重比較檢驗(yàn)差異顯著性（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水鹽脅迫對(duì)棉花葉片氣體交換參數(shù)的影響

表1 給出了不同處理棉花葉片的光合速率、氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度。水鹽脅迫降低了棉花的葉水勢(shì)。T2和T3 處理的葉水勢(shì)分別為-1.21 和-1.23 MPa，顯著低于T1 處理的-0.81 MPa；T4 處理的葉水勢(shì)降低最為明顯，顯著低于T1—T3 處理。干旱脅迫、鹽分脅迫和水鹽脅迫降低了棉花葉片的氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度，均顯著低于T1 處理。T1 處理的葉片光合速率為27.10 μmol/（m2·s），顯著高于T2 和T3 處理，但T2 和T3處理的差異并不顯著。與干旱脅迫和鹽分脅迫處理相比，水鹽脅迫（T4）顯著降低了棉花葉片的光合速率。

表1 各處理棉花葉片氣體交換參數(shù) Table 1 Gas exchange parameters of cotton seedling leaves in different treatments

2.2 不同處理棉花葉片的氣孔特征與色素量

表2 給出了不同處理棉花葉片的氣孔特征。與T1 處理相比，水分脅迫對(duì)棉花葉片的氣孔長(zhǎng)度和寬度影響不顯著，但卻顯著降低了氣孔密度。T3 和T4處理顯著降低了棉花葉片的氣孔密度、氣孔寬度和氣孔長(zhǎng)度，且2 個(gè)處理間差異顯著。

表2 各處理棉花葉片的氣孔特征 Table 2 Stomatal characteristics of cotton seedling leaves in different treatments

表3 各處理棉花葉片的色素量 Table 3 Pigment content of cotton seedling leaves in different treatments

表3 給出了不同處理對(duì)棉花葉片色素量的影響。與T1 處理相比，干旱脅迫（T2）、鹽分脅迫（T3）和水鹽脅迫（T4）均顯著降低了棉花葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類(lèi)胡蘿卜素量。T3 和T4 處理的葉片色素量均顯著低于T2 處理，但T3 和T4 處理只在類(lèi)胡蘿卜素量存在顯著差異。

2.3 不同處理棉花葉片的光合限制因素分析

光合限制因素分析可以量化影響光合過(guò)程的脅迫效應(yīng)。表4 給出了不同處理棉花葉片光合的氣孔（IS）、葉肉（Im）和生化特征（Ib）抑制因子。在無(wú)脅迫條件下（T1），棉花葉片的光合過(guò)程主要受限于生化特征因子。然而，水分脅迫和鹽分脅迫增加了IS和Im值，表明脅迫條件下，CO2從大氣進(jìn)入細(xì)胞羧化位點(diǎn)的阻力在抑制棉花光合性能方面起著主要作用。T2 和T3 處理間的Ib、IS和Im值差異并不顯著，T4處理的Ib和Im值與T2 和T3 處理的差異顯著，但I(xiàn)S并不顯著。

表4 各處理棉花葉片的光合限制因素 Table 4 Limiting factors of cotton leaf photosynthesis in different treatments

表5 各處理棉花葉片吸收光能的消散比例 Table 5 Percentage of leaf absorbed light energy dissipation of cotton seedling in different treatments

2.4 不同處理對(duì)棉花葉片吸收光能分配的影響

利用ΦPSII、ΦNPQ和Φf,D指標(biāo)分析PSII 天線(xiàn)吸收的光子分配到光合電子傳遞和熱耗散。表5 給出不同處理棉花葉片吸收的光能通過(guò)ΦPSII、ΦNPQ和Φf,D消散的比例。在100、500 和1 200 μmol/（m2·s）3 種不同光照條件下，4 個(gè)處理的Φf,D值相對(duì)穩(wěn)定，約占總吸收能量的23%。低光強(qiáng)條件下，ΦNPQ值較低，隨光強(qiáng)的增加ΦNPQ值增加；1 200 μmol/（m2·s）下的ΦNPQ平均值為0.645，表明脅迫條件下熱耗散是消除過(guò)剩光能的主要途徑。與ΦNPQ不同的是，ΦPSII隨光強(qiáng)的增加而逐漸降低；在高光強(qiáng)條件下，消除的光能低于20%。結(jié)果表明，在脅迫條件下棉花主要通過(guò)熱耗散來(lái)消除過(guò)剩的光能。

3 討 論

氣孔是植物葉片與外界氣體交換和水分散失的主要通道，也是影響植物光合蒸騰過(guò)程的主要因素之一。植物能夠根據(jù)環(huán)境因子的變化而調(diào)節(jié)氣孔分布、氣孔密度及氣孔大小，使植物在損失水分較少的條件下獲取最多的CO2。在本研究的水分和鹽分脅迫條件下，棉花葉片的氣孔開(kāi)度和密度降低、氣孔導(dǎo)度下降，導(dǎo)致進(jìn)入葉片的CO2質(zhì)量濃度降低，進(jìn)而降低葉片光合速率，這與已有研究結(jié)果相一致[20-22]。本研究中的水分脅迫為中度脅迫，150 mmol/L 鹽分脅迫對(duì)于棉花幼苗是較高的鹽分脅迫，也是常用的棉花鹽分脅迫水平[12]。Flexas 等[23]與Cano 等[24]認(rèn)為干旱脅迫下植物葉片葉綠體內(nèi)的CO2質(zhì)量濃度降低是光合速率降低的主要因素；江曉慧等[12]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫使葉片氣孔下腔到葉綠體羧化點(diǎn)CO2的路徑受損，CO2傳輸效率降低。上述研究均表明脅迫條件下植物葉片的葉肉導(dǎo)度降低、阻力增加，光合速率受葉肉因素限制而降低。本研究發(fā)現(xiàn)水鹽脅迫T4 處理的氣孔開(kāi)度和密度均顯著低于T2 和T3 處理，而且T4 處理的氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度也顯著低于T2 和T3 處理，表明水鹽脅迫植株葉片光合速率的非氣孔限制貢獻(xiàn)要高于T2 和T3 處理。

水分脅迫[25-26]和鹽分脅迫[27-28]都可顯著抑制光合色素的合成，進(jìn)而降低了水分和鹽分脅迫對(duì)植株的傷害。本試驗(yàn)的T2 和T3 處理的棉花葉片色素量均顯著低于T1 處理，而水鹽脅迫T4 處理的色素量又較T2 和T3 處理顯著降低。水鹽脅迫降低葉片色素量的原因可能是色素合成受阻以及脅迫增強(qiáng)葉綠素酶活性、加速了葉綠素分解；而類(lèi)胡蘿卜素的降低可能是由于脅迫所產(chǎn)生的活性氧破壞了色素分子所致[28-29]。尹海龍等[28]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下葉綠素下降的主要原因是葉綠素a 量降低，而本研究中T3—T4 處理棉花葉片的葉綠素a 和葉綠素b 量均較T1 處理顯著降低，供試植物與鹽分質(zhì)量濃度的不同可能是導(dǎo)致研究結(jié)論不一致的主要原因。

植物光合碳同化能力下降的主要因素包括氣孔限制和非氣孔限制，而植物光合是受氣孔限制還是非氣孔限制，取決于植物自身和生境條件[30-31]。但植物光合過(guò)程是受氣孔限制還是非氣孔限制，尚無(wú)一致的結(jié)論。本研究中，T2—T4 處理的IS（平均值為38%）較T1 處理（18%）約增加了1.1 倍，表明脅迫條件下氣孔限制對(duì)棉花葉片光合速率降低的貢獻(xiàn)約占38%，而非氣孔限制的貢獻(xiàn)占了62%。在非氣孔限制因素中，脅迫處理的Ib降低了45%，但I(xiàn)m增加了40%，表明葉肉導(dǎo)度降低引起的CO2傳輸阻力增加是棉花葉片光合速率降低的主要非氣孔因素。T2—T4 處理的IS和Im值相差不大，平均值分別為0.38 和0.35，表明脅迫降低棉花葉片光合速率主要是由于氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度的降低。Wang 等[32]也認(rèn)為氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度降低是干旱脅迫降低葉片光合速率的主要因素，這與本研究的結(jié)論相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)受水鹽脅迫的棉花主要通過(guò)基礎(chǔ)過(guò)程（熱和熒光耗散）來(lái)耗散過(guò)剩的能量，這與Riva-Roveda 等[34]的研究結(jié)果相一致。1 200 μmol/（m2·s）下棉花葉片的ΦNPQ平均值為0.645，較高的ΦNPQ說(shuō)明光合機(jī)構(gòu)吸收的光能更多的是處于過(guò)剩狀態(tài)，但植株仍可通過(guò)調(diào)節(jié)熱耗散機(jī)制來(lái)消除過(guò)剩能量帶來(lái)的危害。

4 結(jié) 論

1）150 mmol/L 的鹽分處理和水鹽處理（150 mmol/L 鹽分與中度水分脅迫）顯著降低了棉花葉片的氣孔密度、氣孔寬度和氣孔長(zhǎng)度，顯著降低了棉花葉片的葉綠素a、葉綠素b 和類(lèi)胡蘿卜素量。

2）脅迫條件下，氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度降低在抑制棉花光合性能方面起著主要作用。當(dāng)葉片光合性能受到抑制時(shí)，植株主要通過(guò)熱耗散途徑來(lái)消除過(guò)剩能量。