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    高通量測序及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

    2020-11-28 16:27:41張閆佳
    科技與創(chuàng)新 2020年12期
    關(guān)鍵詞:高通量基因組靶向

    張閆佳

    高通量測序及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

    張閆佳

    (河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

    隨著DNA測序技術(shù)的進一步成熟,我們對人類基因組和各類疾病在基因方面的研究得到了很大進展。通過對人類的基因組進行測序,我們已經(jīng)能夠比較全面地了解某些基因是如何運行的及其形式、功能。尤其在某些疾病的診斷方面,高通量測序技術(shù)(HTS)發(fā)揮著更大的作用。通過對患者病變細胞的基因組進行測序,已經(jīng)能夠?qū)υ摲N疾病進行更深入的研究,以改善許多疾病的診斷分類、預(yù)后和治療選擇。這種新的DNA測序方法正在向臨床過渡,且可能使醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域,如診斷領(lǐng)域產(chǎn)生較大的變化。在這里將介紹目前為止利用高通量測序技術(shù)進行研究,進而得到的一些主要發(fā)現(xiàn)結(jié)果,有助于了解高通量測序在心血管疾病、智力障礙和苯丙酮尿癥等疾病分子診斷中的應(yīng)用。

    DNA測序技術(shù);高通量測序;分子診斷;基因

    1 前言

    隨著科技的進步,人類的壽命也越來越長,這與人們對疾病方面的研究有著極大關(guān)系。以前,人們以為疾病是一種懲罰,沒有任何科學(xué)依據(jù)?,F(xiàn)在,隨著人們對環(huán)境和人類基因的認(rèn)知越來越深刻,人們了解到目前為止很多疾病都與環(huán)境或者基因,其中尤其是遺傳病與基因有著非常大的關(guān)聯(lián)。而從低通量測序到當(dāng)下的高通量測序,我們對基因組的序列的理解更勝一籌。高通量測序技術(shù)能夠?qū)Χ鄠€DNA分子進行并行測序,甚至使數(shù)億個DNA分子做到同時測序。這一優(yōu)勢使得高通量測序可以用于創(chuàng)建大數(shù)據(jù)庫,使我們對各種疾病和發(fā)育階段的細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組的特征有一個更全面的了解。高通量測序技術(shù)不僅極大地提高了DNA測序的效率,而且在很大程度上降低了成本。同時,由于該技術(shù)通常具有較好的特異性、較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,它在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)以及基因變異的研究中有了很好的應(yīng)用。

    DNA測序技術(shù)的此項進展意味著病理學(xué)家、遺傳學(xué)家和其他醫(yī)學(xué)學(xué)科的成員現(xiàn)在看到的是大量新的遺傳數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)為疾病的易感性、發(fā)病機制、預(yù)后和治療策略提供了很大的幫助。而對于我們來說,了解這些使用新的高通量測序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)、在獲得測序結(jié)果后做出的選擇以及在數(shù)據(jù)分析和表觀遺傳等方面是至關(guān)重要的。此外,除了處理這些數(shù)據(jù)得到的顯而易見的結(jié)果之外,這些大量的高通量測序數(shù)據(jù)還包含了一些其他的發(fā)現(xiàn),盡管有的發(fā)現(xiàn)目前的意義還不是很明確。但當(dāng)進行到相關(guān)研究時,一定會顯現(xiàn)出它的用途。

    2 高通量測序與分子診斷

    2.1 高通量測序技術(shù)

    基因被轉(zhuǎn)錄成RNA,然后RNA被翻譯成蛋白質(zhì),這即是分子生物學(xué)的中心法則。這個法則概述了基因的可變表達——如何從單個基因組動態(tài)地控制細胞地位和功能?;蚴呛愣ǖ?,但基因表達是動態(tài)的,而且會受到轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響,導(dǎo)致細胞內(nèi)主要功能發(fā)生改變。

    如果潛在的DNA序列發(fā)生突變,或者在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中發(fā)生改變,細胞功能就可能受到影響,進而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。雖然細胞所在的環(huán)境也會影響疾病的表現(xiàn),但是許多疾病也有一個強大的潛在遺傳成分。因此,為了評估一個人的遺傳背景是否會導(dǎo)致疾病,需要大量的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。通過對多個基因組進行測序,可以研究人類基因組的多樣性。隨著高通量測序技術(shù)的逐步發(fā)展,測序成本已經(jīng)大大降低,很快就可以以更低的價錢來測序整個人類的基因組了。盡管如此,目前還面臨著一個重要的挑戰(zhàn)——將基因組測序用于臨床方面的數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。其實,每一種DNA測序技術(shù)都不可避免地有其錯誤模式和出錯率。當(dāng)前,許多高通量測序應(yīng)用程序試圖通過為每個要確定的堿基獲得許多獨立的序列,來克服這個障礙。在不久的將來,從高通量測序?qū)嶒炛蝎@得的復(fù)雜數(shù)據(jù)的解釋,將大大有益于生物學(xué)的研究。

    靶向高通量測序基本是對患者的患病細胞進行測序,經(jīng)過擴增后使用Illumina高通量測序方法進行測序。其中,可以利用在線設(shè)計工具設(shè)計一組測序引物,對若干個相關(guān)的基因的外顯子和±10 bp側(cè)內(nèi)含子進行測序。用DNA樣本來制備捕獲的目標(biāo)基因文庫,然后在NEXTSEQ500測序器中對DNA文庫進行測序。也可以用通用引物對線粒體(mt)16S rRNA基因進行擴增,同時使用Illumina高通量測序方法進行測序??偠灾?,許多研究結(jié)果證明了這些靶向高通量測序方法的潛力,它可以全面描述測序出的基因組數(shù)據(jù),并建立數(shù)據(jù)庫,為開發(fā)更好地基于數(shù)據(jù)做出的策略以及在重要遺傳疾病的預(yù)防方面作出更大的貢獻。

    2.2 遺傳分析與分子診斷

    2.2.1 疾病的遺傳變異分析

    在對高通量測序應(yīng)用數(shù)據(jù)的分析中,經(jīng)常出現(xiàn)一些關(guān)鍵問題。最重要的一個問題是如何處理罕見的序列變異,這可能是了解重要的個體病人的疾病的發(fā)病機理、預(yù)后或治療的關(guān)鍵一步。但首先,在分析可能與人類疾病相關(guān)的基因組序列變異之前,我們必須先對健康人群的遺傳變異有一個基本的了解。最近,1 000個基因組計劃的試驗階段發(fā)現(xiàn)低頻序列變異,并調(diào)查更罕見的變異,特別是外顯子。而后,公布的數(shù)據(jù)從個體人類基因組序列和1 000人基因工程的初步結(jié)果,顯示支持先前估計的人類基因組變異的頻率位置。這些數(shù)據(jù)大大提升了我們對序列變異的類型和分布的理解。

    2.2.2 來自高通量測序的分子診斷見解

    人類可能至少有5 000~6 000個單基因疾病,目前大約有4 000種疾病與OMIM(在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫)中已知的基因變化有關(guān)。目前利用HTS發(fā)現(xiàn)致病突變的速度表明,在未來幾年內(nèi),將確定導(dǎo)致許多其他疾病的突變序列。這些發(fā)現(xiàn)可能會促使疾病的重新分類,或者促使我們更好地理解疾病的臨床癥狀。目前外顯子組測序已經(jīng)成功地在發(fā)現(xiàn)基因病上發(fā)揮較大作用。

    3 高通量測序在各種疾病分子診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀分析

    3.1 高通量測序技術(shù)闡明心血管疾病的分子途徑

    HTS有潛力在心血管研究中發(fā)揮重要作用,因為許多疾病具有未知的潛在遺傳成分。例如,心律失常性右心室發(fā)育不良/心肌?。ˋRVD/C)是由橋粒相關(guān)突變引起的。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種基因突變導(dǎo)致ARVD/C,但只有50%~60%的ARVD/C患者發(fā)現(xiàn)潛在的基因突變。此外,ARVD/C的一些臨床表現(xiàn)與Brugada綜合征非常相似。而全基因組和外顯子組測序使我們發(fā)現(xiàn)以前未知的導(dǎo)致心血管疾病的突變,并有助于區(qū)分具有非常相似臨床表現(xiàn)的不同疾病。

    高通量測序技術(shù)的進步使心臟發(fā)育和疾病過程的表征更加準(zhǔn)確和全面。隨著不同平臺對HTS應(yīng)用程序的改進,將為生物過程的功能提供更完整的分子圖像。這對我們找尋心血管疾病更安全、更有效的治療方法有很大幫助。HTS技術(shù)的實施將在確定心血管疾病發(fā)展和疾病的分子通路方面具有不可估量的價值。

    3.2 采用靶向高通量測序?qū)χ橇φ系K進行分子診斷

    智力障礙(ID)是一種常見的神經(jīng)發(fā)育障礙,在兒童和青少年中發(fā)病率為1.5%~2%。分類智力障礙(ID)的特征是極端的遺傳異質(zhì)性。但幾百個基因與單基因形式的ID相關(guān),這大大增加了分子診斷的復(fù)雜性。Claire Redin和他的團隊鑒定了26個致病突變中的16個,常染色體顯性基因中的10個新生突變。其中,一些基因多次出現(xiàn),表明它們更頻繁地與ID相關(guān)條件對應(yīng)。

    結(jié)果表明,靶向測序的診斷率為25%。在這些患者中,不論其認(rèn)知障礙的嚴(yán)重程度如何,有25%的患者都檢測到一種因果突變。這項工作表明,靶向測序方法在診斷ID方面是高效的,也將有助于我們更好地了解ID和自閉癥中涉及的許多基因的具體功能。

    3.3 采用高通量靶向測序?qū)Ρ奖虬Y和四氫生物堿缺乏的高苯丙氨酸血癥進行分子診斷

    苯丙酮尿癥(PKU)和四氫生物堿缺乏的高苯丙氨酸血癥(BH4DH)的遺傳診斷,曾經(jīng)依賴于掃描已知突變的方法或使用Sanger測序的一些費力的分子工具。目前,Daniel Trujillano和他的團隊實現(xiàn)了一種基于4個基因的高通量多靶點重測序的新型高效策略,當(dāng)這些基因受到功能缺失突變的影響時,就會導(dǎo)致PKU和BH4DH。他們已經(jīng)在95個樣本中驗證了這一方法,檢測樣本中所有已知的致病突變。然后,使用MiSeq測序儀對11例無特征的HPA患者進行了相同的捕獲分析。他們的研究證明了高通量靶向重測序已準(zhǔn)備好替代經(jīng)典分子方法來進行BH4DH的鑒別遺傳診斷,允許在出生后幾天內(nèi)建立專門定制的治療,有很高的使用價值。

    4 問題及展望

    高通量測序方法具有成本低、診斷速度快、精度高等優(yōu)點,同時可以檢測到大量的突變,通常也可以做出精確的分子診斷,然而,基因測序作為一個領(lǐng)域還不夠成熟,面臨著更多的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如,為了使測序在臨床中得到更廣泛的應(yīng)用,準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的,可能會存在一些數(shù)據(jù)的可用性和能力之間的差距。這一差距可能需要更好的算法來糾正閱讀錯誤,并借助先進的分子生物學(xué)技術(shù)。

    因此,HTS基因檢測是診斷設(shè)備的強大補充,但可能不會完全取代目前的大多數(shù)診斷方法。將高通量DNA測序數(shù)據(jù)集納入患者的臨床護理還需要一段過渡期,在此期間,臨床決策將僅基于對已知重要性的序列變異的可靠解釋。盡管這一知識體系已經(jīng)變得復(fù)雜而詳細,但迄今為止通過高通量靶向測序方法幾乎在所有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的重大發(fā)現(xiàn),可能只是對未來的一瞥。

    [1]張坡,李茜,朱艷,等.靶向捕獲高通量測序技術(shù)在遺傳性疾病分子診療中的應(yīng)用[J].中國婦幼保健,2019,34(10):2313-2315.

    [2]鮑蕓,肖艷群,王華梁.高通量測序技術(shù)在五類疾病分子診斷中的應(yīng)用及質(zhì)量管理策略[J].中華臨床實驗室管理電子雜志,2018,6(2):69-73.

    R440

    A

    10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.071

    2095-6835(2020)12-0160-02

    張閆佳(1999—),女,河南輝縣人,河南師范大學(xué)2017級生物科學(xué)專業(yè)在讀本科生。

    〔編輯:王霞〕

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