變性梯度凝膠電泳技術(shù)在馬屬動物腸道微生物多樣性研究中的應(yīng)用＊

劉驍蒨，尤凡，尹航，馬智超

變性梯度凝膠電泳技術(shù)在馬屬動物腸道微生物多樣性研究中的應(yīng)用＊

劉驍蒨，尤凡，尹航，馬智超

（武漢商學(xué)院體育學(xué)院 國際馬術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

馬屬動物腸道微生物在馬匹健康和性能方面都起著至關(guān)重要的作用。為了探究馬屬動物腸道微生物多樣性，對變性梯度凝膠電泳技術(shù)在馬屬動物腸道微生物多樣性和菌群結(jié)構(gòu)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，指出目前常用的分子生物學(xué)技術(shù)PCR-DGGE技術(shù)在分析動物腸道微生物多樣性方面具有快速、精確等優(yōu)點(diǎn)，表明PCR-DGGE技術(shù)是篩選優(yōu)勢菌株和分離有害菌等的有效手段，該技術(shù)為馬屬動物腸道微生物研究奠定了基礎(chǔ)。

變性梯度凝膠電泳；馬屬動物；腸道微生物；菌群多樣性

馬屬動物腸道內(nèi)存在種類繁多的微生物，這些微生物和動物之間通過復(fù)雜的機(jī)制調(diào)節(jié)動物的消化吸收能力。因此，研究馬屬動物腸道微生物的結(jié)構(gòu)，了解微生物和寄主以及微生物間的作用和功能，也為新功能菌株的發(fā)現(xiàn)利用提供理論基礎(chǔ)，對維持馬屬動物健康和治療相關(guān)疾病具有重要意義。用傳統(tǒng)的方法培養(yǎng)微生物只能培養(yǎng)出一部分菌種，分析出的菌種種類受到限制，其反映出的微生物種類和群落并不準(zhǔn)確。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，越來越多的新型儀器和手段被用于分析微生物多樣性。其中變性梯度凝膠電泳技術(shù)具有檢測率高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)被迅速應(yīng)用于馬屬動物腸道微生物的多樣性研究中。

1 馬屬動物腸道微生物種類

馬屬動物腸道中存在著大量的微生物，微生物與宿主屬于互利共生的關(guān)系，腸道中的優(yōu)勢厭氧菌主要有革蘭氏陽性菌、梭菌等，其次還有鏈球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌等[1]。乳酸桿菌是十二指腸中的優(yōu)勢菌群，而回腸中的優(yōu)勢菌群主要是大腸桿菌和鏈球菌。另外，厭氧纖維素菌群中瘤胃球菌屬在小馬胃腸中屬于優(yōu)勢地位。動物腸道內(nèi)的益生菌和腸道黏膜上皮特異性受體結(jié)合，形成重要的生物屏障，抵抗致病菌的侵蝕。益生菌在維護(hù)動物腸道健康和增強(qiáng)免疫力方面起著重要的作用。

2 馬屬動物腸道微生物的功能

2.1 提高免疫力

有研究證明，缺乏菌的動物腸道粘膜免疫及全身免疫系統(tǒng)都會出現(xiàn)異常，局部和全身淋巴系統(tǒng)也會出現(xiàn)缺陷。動物腸道免疫系統(tǒng)的建立和維持都離不開腸道微生物的存在。正因?yàn)橛辛四c道益生菌才能夠維持免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作，一旦腸道微生物群落遭到破壞就會提升機(jī)體炎癥的發(fā)生率。

2.2 增加屏障作用

動物腸道屏障的構(gòu)建物包括腸道內(nèi)的物質(zhì)，如微生物群落、代謝產(chǎn)物、黏液層、粘膜正常微生物菌群和定植抗力、粘膜上皮細(xì)胞等。動物腸道內(nèi)的益生菌定植于腸道腔壁上，是腸道系統(tǒng)的一道強(qiáng)有力的物理屏障，對于動物腸道的健康保駕護(hù)航，同時(shí)對病原微生物起到了一定的排斥作用，并且對機(jī)體產(chǎn)生有益的刺激，促進(jìn)抗菌物質(zhì)的生成。

2.3 促進(jìn)物質(zhì)的消化吸收

馬屬動物腸道微生物直接影響著動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。馬屬動物體內(nèi)不同種類微生物都不斷地發(fā)揮著各自的作用，它們能增加動物對小分子物質(zhì)的吸收，促進(jìn)動物對能量的吸收和利用。

3 PCR-DGGE技術(shù)概述

3.1 PCR-DGGE技術(shù)原理

基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的變性梯度凝膠電泳（PCR- DGGE）是一種指紋圖譜分析技術(shù)，其原理是利用不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，其解鏈的溫度不同，將其區(qū)分開來。擴(kuò)增16S rDNA可變區(qū)的目的片段，得到等長的雙鏈DNA片段，使其在變性凝膠中進(jìn)行電泳，因?yàn)閿U(kuò)增到堿基對不同，其解鏈所需的聚丙烯酰胺濃度也不一樣，進(jìn)行電泳時(shí)，長度相同但堿基排列不同的DNA片段會停在凝膠的不同位置上，形成不同條帶的圖譜。理論上在精確的條件下（變性劑梯度、電泳時(shí)間、電壓等合適），DGGE技術(shù)可區(qū)分僅有1個堿基區(qū)別的DNA片段。

3.2 PCR-DGGE操作方法

使用PCR-DGGE技術(shù)分析馬屬動物腸道微生物多樣性的實(shí)驗(yàn)步驟有：首先是動物腸道內(nèi)樣本的采集，其次提取采集到的樣本的總基因組DNA，接著使用 PCR方法擴(kuò)增16S rRNA基因的目的片段，再將擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，隨后取出凝膠用銀離子染色及獲得圖片，將優(yōu)勢條帶用刀切割下來進(jìn)行回收，對凝膠電泳圖使用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

提取核酸檢測時(shí)，首先要提取腸道內(nèi)樣本中的DNA。學(xué)者研究提取總DNA的方法包括酶法、珠磨法及凍融研磨法等。通過比對，劉健華等[2]采用不同方法提取動物的糞便DGGE結(jié)果表明，酶法的裂解效果最差，而珠磨法提取糞便細(xì)菌核酸的效果最優(yōu)。

用PCR的方法擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，利用細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)序列高度一致的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出不同的細(xì)菌菌群，然后再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳PCR-DGGE，區(qū)分出不同堿基序列的細(xì)菌。

凝膠電泳后進(jìn)行染色即顯示出指紋圖譜，目前常用的對凝膠進(jìn)行染色方法是銀染法。銀染法的原理是先使銀離子與核酸結(jié)合成復(fù)合物，再用還原劑將銀離子還原，即黑褐色的條帶出現(xiàn)在凝膠上。

根據(jù)遺傳指紋，對圖譜中條帶使用軟件進(jìn)行分析，獲得細(xì)菌群落的種群關(guān)系。電泳條帶的數(shù)目反映細(xì)菌種類的多少，電泳條帶的濃淡可以反映細(xì)菌的密度。對圖譜分析時(shí)，常用的指標(biāo)包括Shannon多樣性參數(shù)，可對腸道微生物進(jìn)行多樣性進(jìn)行分析。為獲得進(jìn)一步的信息，可使用種群專一性探針與得到的條帶進(jìn)行雜交或建立細(xì)菌16S rDNA文庫或?qū)l帶切割擴(kuò)增后測序，從而進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

4 馬屬動物腸道微生物的研究

目前對于人類、反芻動物、家禽、豬等的腸道微生物已成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，但對于馬屬動物腸道微生物的研究并不多見。糞便作為馬屬動物腸道微生物研究的樣本是切實(shí)有效的，并且新鮮糞便中有大量的微生物，但可培養(yǎng)細(xì)菌種群卻不多。國內(nèi)關(guān)于馬腸道微生物的研究僅有為數(shù)不多的幾個，如伊如格勒圖[3]對蒙古馬和純血馬腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行的研究，證明了馬糞便中存在著大量的細(xì)菌微生物，且大部分是不可培養(yǎng)的未知菌種，具有寶貴的遺傳學(xué)研究意義。邢振存[4]研究指出蒙古馬和純血馬腸道內(nèi)真菌種群結(jié)構(gòu)豐富，且兩種馬匹優(yōu)勢真菌種群不完全一致，菌種幾乎分別屬于子囊菌門、擔(dān)子菌門和新麗鞭毛菌門，以子囊菌門含量最多。蒙古馬和純血馬共有菌屬包括胃梨囊霉屬、牛糞盤菌、細(xì)齒糞盤菌等。

DOUGAL等[5]對純血馬和矮種馬的腸道微生物多樣性進(jìn)行研究后，結(jié)果顯示同種動物大腸內(nèi)微生物種群很接近，它們的優(yōu)勢菌群主要為厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門、變形菌門和放線菌門。PROUDMAN等[6]通過對馬匹腸道微生物種群結(jié)構(gòu)的研究來判斷馬匹的腸道以及機(jī)體的健康狀況。不同飼料對馬匹腸道微生物種類的影響也不一樣，F(xiàn)OMBELLE等[7]研究指出馬屬動物喂養(yǎng)不同的飼料后，其腸道微生物的菌群明顯不同，飼喂大麥的馬匹與飼喂干草的馬匹相比，其盲腸和結(jié)腸中的厭氧菌，如乳酸桿菌和鏈球菌均顯著增加，且腸道內(nèi)纖維素分解菌的群落結(jié)構(gòu)也不相同。

在患病馬匹和健康馬匹腸道微生物的研究中，COSTA等人[8]對6匹健康馬匹與10匹患結(jié)腸炎馬匹進(jìn)行研究表明，利用細(xì)菌16S rDNA法獲得的198 748條序列，結(jié)果表明健康的馬厚壁菌門含量較高占到68%，其次是細(xì)菌占到14%。MORITA等[9]對日本一個馬場飼養(yǎng)的馬匹，使用PCR-DGGE技術(shù)檢測了患有腸炎種馬的胃腸道菌群多樣性，研究結(jié)果顯示，健康馬匹的胃腸道大腸桿菌數(shù)量明顯高于腹瀉馬匹排泄物中大腸桿菌數(shù)量，PCR-DGGE技術(shù)能夠成為馬屬動物胃腸道群落結(jié)構(gòu)研究的手段。

5 展望

PCR-DGGE技術(shù)是一種快速有效分析微生物多樣性的技術(shù)手段，該手段是通過PCR擴(kuò)增等長的目的片段，通過電泳區(qū)分不同堿基排列的條帶，每個條帶相當(dāng)于一種微生物菌群，條帶的明暗可以反映微生物群落的數(shù)量。它的優(yōu)點(diǎn)在于PCR-DGGE技術(shù)可以獲得不可培養(yǎng)的微生物多樣性信息，可以分析到的微生物群落數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)的超過了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。目前，在微生物多樣性的研究中PCR-DGGE技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，且將該方法與其他分子生物學(xué)手段聯(lián)合使用，能夠更全面地分析微生態(tài)等方面。近年來，越來越多的研究者也將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于腸道微生物的研究上，但人們對馬屬動物腸道微生物的研究卻相對較少。隨著人們生活水平的提高，現(xiàn)代馬業(yè)已成為了一種新型產(chǎn)業(yè)，而在養(yǎng)馬的過程中，馬屬動物腸道的健康狀況受到日益重視，采用PCR-DGGE技術(shù)開展馬屬動物腸道微生物相關(guān)研究，通過對其胃腸道內(nèi)微生物多樣性的測定以及研究飼料等因素對其腸道菌群多樣性的影響，將為馬屬動物的飼養(yǎng)、疾病的治療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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［3］伊如格勒圖.蒙古馬腸道細(xì)菌多樣性的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［4］邢振存.蒙古馬和純血馬腸道真菌多樣性初步研究及分析［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［5］DOUGAL K，DE LA FUENTE G，HARRIS P A，et al.Identification of a core bacterial community within the large intestine of the horse［J］. PloS one，2013，8（10）：e77660.

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劉驍蒨（1983—），女，四川仁壽人，博士，講師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動人體科學(xué)。

武漢商學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目“速度賽馬馬匹腸道微生物多樣性的研究”（編號：2014A011）

2095－6835（2020）10－0156－02

Q95

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.10.070

〔編輯：王霞〕