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    骨髓增殖性疾病診斷綜合分析的意義

    2016-01-20 01:02:39唐吉斌焦瑞寶曹春鸞崇慧峰鐘維君
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:癥組突變率繼發(fā)性

    周 萍, 唐吉斌, 焦瑞寶, 章 文, 曹春鸞, 崇慧峰, 鐘維君

    (1.銅陵市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,安徽 銅陵 244009;2.艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,浙江 杭州 310000)

    骨髓增殖性疾病診斷綜合分析的意義

    周萍1,唐吉斌1,焦瑞寶1,章文1,曹春鸞1,崇慧峰1,鐘維君2

    (1.銅陵市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,安徽 銅陵 244009;2.艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,浙江 杭州 310000)

    摘要:目的探討骨髓增殖性疾病(MPD)患者JAK2基因V617F點(diǎn)突變情況以及與血細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞形態(tài)結(jié)合對診斷的意義。方法對102例外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)有不同程度增高的患者采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測JAK2基因V617F點(diǎn)突變,并同步進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果54例MPD患者中真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者的JAK2基因V617F突變率分別為91.7%、50.0%、66.7%,48例非MPD患者(包括繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥、繼發(fā)性血小板增多癥、繼發(fā)性骨髓纖維化)均未檢測到JAK2V617F突變;兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MPD組與非MPD組之間有部分血細(xì)胞計(jì)數(shù)值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MPD組骨髓細(xì)胞形態(tài)具有一定特征。結(jié)論MPD患者JAK2基因V617F點(diǎn)突變率明顯高于繼發(fā)性血液學(xué)異常,與血細(xì)胞計(jì)數(shù)及骨髓細(xì)胞形態(tài)結(jié)合對診斷有重要意義。

    關(guān)鍵詞:骨髓增殖性疾病;JAK2基因V617F點(diǎn)突變;骨髓細(xì)胞形態(tài);血細(xì)胞計(jì)數(shù)

    中圖分類號:

    文章編號:1673-8640(2015)01-0026-05R446.11

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:碼:A

    DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.007

    Abstract:ObjectiveTo investigate the significance of V617F mutation in JAK2 gene combining cytometry and bone marrow cell morphology on the diagnosis of myeloproliferative disease (MPD). MethodsOf the 102 cases whose peripheral blood number increased with various degrees, the real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) was applied to detect the V617F mutation in JAK2 gene, and the cell morphology of bone marrow was observed. ResultsIn the 54 cases of MPD, including polycythemia vera (PV) and essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF), the positive rates of JAK2 V617F mutation were 91.7%, 50.0% and 66.7% respectively, while JAK2 V617F mutation was not detected in the 48 non-MPD cases with statistical significance (P<0.05). Between MPD and non-MPD groups, the value of part blood cell count had statistical significance (P<0.05). There existed a certain characteristic on bone marrow cell morphology in MPD group. ConclusionsCompared with patients with secondary blood disease, MPD patients display higher frequency of V617F mutation in JAK2 gene, and there is vital significance for the diagnosis with combination of cytometry and bone marrow cell morphology.

    作者簡介:周萍,女,1976年生,學(xué)士,主管技師,主要從事血液學(xué)檢驗(yàn)工作。

    通訊作者:唐吉斌,聯(lián)系電話:0562-2827195。

    收稿日期:(2014-10-12)

    Significance of comprehensive analysis on the diagnosis of myeloproliferative diseaseZHOUPing1,TANGJibin1,JIAORuibao1,ZHANGWen1,CAOChunluan1,CHONGHuifeng1,ZHONGWeijun2.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TonglingPeople′sHospital,AnhuiTongling244009,China; 2.ADICONClinicalLaboratories,ZhejiangHangzhou310000,China)

    Key words: Myeloproliferative disease;JAK2 gene V617F mutation; Bone marrow cell morphology; Blood cell count

    在2008年第4版世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于髓系腫瘤分類中,將骨髓增殖性疾病(myelo-proliferative disorders,MPD)更名為骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN),僅將融合基因(BCR-ABL)陰性的真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera,PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia,ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis,PMF)列入MPD[1],這一分型改變源自對血液系統(tǒng)腫瘤分子致病機(jī)制的逐步了解。2005年國際上多個研究組[2-3]的研究顯示,PV、ET和PMF中普遍存在著JAK2基因V617F點(diǎn)突變。在臨床上,MPD患者也有部分未見JAK2V617F突變,與繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥、繼發(fā)性血小板增多癥(secondary thrombocythemia,ST)、繼發(fā)性骨髓纖維化的鑒別診斷需結(jié)合外周血造血細(xì)胞數(shù)量增多程度和骨髓象形態(tài)特征等其它診斷指標(biāo),特別在癥狀不明顯的疾病早期階段。因此,我們就MPD相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)合作一分析總結(jié),為臨床診斷提供一定的參考價(jià)值。

    材料和方法

    一、材料

    1.標(biāo)本來源2010年1月至2014年7月銅陵市人民醫(yī)院門診及住院病例102例,男50例,女52例,年齡9~83歲。其中PV 24例,ET 24例,PMF 6例,繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥16例,ST 22例,繼發(fā)性骨髓纖維化10例。所有疾病診斷參考2008年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)[1]診斷標(biāo)準(zhǔn)。

    2.標(biāo)本采集所有病例抽取骨髓液(或外周血)2 mL,乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝,外周血2 mL(EDTA-K2抗凝)及骨髓穿刺涂片數(shù)張。

    3.主要儀器和試劑SYSMEX XT2000i 全自動血液分析儀,聚次甲基染料、氨丁三醇緩沖液、鞘液、質(zhì)控品等均為原裝配套試劑。美林恒通Merinton SMA1000型紫外分光光度計(jì)。ABI 7500熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀。DNA抽提試驗(yàn)盒購自北京天根公司(血液/細(xì)胞/組織基因提取試劑盒),PCR反應(yīng)體系試劑使用TOYOBO公司的THUNDERBIRD qPCR Mix成品試劑盒,引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)合成。

    二、方法

    1.外周血采取常規(guī)血細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測,骨髓涂片經(jīng)瑞氏染色,對有核細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察。

    2.基因組DNA提取抽取患者骨髓或外周血2 mL,EDTA抗凝,用DNA抽提試驗(yàn)盒按照說明書抽提基因組DNA。用紫外分光光度計(jì)測量濃度并確定純度后將DNA終濃度調(diào)節(jié)為50~100 ng/μL(常規(guī)提取時濃度為25~250 ng/μL,A260 nm/A280 nm為1.8~2.0)。

    3.JAK2基因V617F點(diǎn)突變檢測在NCBI上下載JAK2基因序列,針對JAK2基因第14外顯子設(shè)計(jì)相關(guān)引物,正義引物1條和反義引物1條,野生型和突變型探針各1條,分別為VIC和FAM標(biāo)記,使用雙蒸水稀釋引物和探針(儲存濃度100 ng/μL,工作濃度10 ng/μL)。按試劑盒說明書要求配置20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,加入模板2 μL,混勻離心。采用實(shí)時熒光PCR檢測JAK2基因V617F突變。反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性1 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,共45個循環(huán),在60 ℃ 1 min采集熒光信號,陽性對照使用陽性質(zhì)粒,空白對照使用雙蒸水, 擴(kuò)增后直接使用熒光PCR分析軟件分析檢測結(jié)果。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    結(jié)果

    一、JAK2基因熒光PCR擴(kuò)增曲線

    JAK2基因擴(kuò)增曲線見圖1,其中陽性結(jié)果見圖2、陰性結(jié)果見圖3。

    圖1 JAK2基因熒光PCR擴(kuò)增曲線

    圖2 JAK2基因V617F突變陽性曲線

    圖3 JAK2基因V617F突變陰性曲線

    二、MPD組和非MPD組JAK2基因V617F點(diǎn)突變情況及突變陽性率比較

    MPD組PV、ET、PMF中JAK2基因V617F點(diǎn)突變率分別為91.7%、50.0%、66.6%,非MPD組繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥、ST、繼發(fā)性骨髓纖維化均未檢測到JAK2基因V617F點(diǎn)突變,見表1。MPD組與非MPD組JAK2基因V617F突變陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.833,P<0.05),見表2。

    表1 各組JAK2基因V617F點(diǎn)突變情況

    三、各組間血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

    PV組白細(xì)胞(white blood cell, WBC)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、血小板(platelet, PLT)均高于繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥組(P<0.05),見表3。ET組PLT高于繼發(fā)性血小板增多癥組(P<0.05),而WBC和Hb差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。PMF組與繼發(fā)性骨髓纖維化組之間血細(xì)胞計(jì)數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表5。

    表2 MPD組與非MPD組JAK2基因V617F點(diǎn)突變

    表3PV組與繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥組血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

    組別例數(shù)WBC(×109/L)Hb(g/L)PLT(×109/L)PV組2415.03±5.14178.90±14.13526.50±206.90繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥組169.68±5.20158.25±19.15182.75±97.18

    表4ET組與繼發(fā)性血小板增多癥組血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

    組別例數(shù)WBC(×109/L)Hb(g/L)PLT(×109/L)ET組2410.27±4.29122.38±19.21757.58±254.92繼發(fā)性血小板增多癥組228.66±3.22112.27±15.43496.64±175.66

    表5 PMF組與繼發(fā)性骨髓纖維化組血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 [M(P25,P75)]

    討論

    MPD多有不同程度的脾大和靜脈血栓形成的臨床表現(xiàn),外周血出現(xiàn)一系或多系的血細(xì)胞數(shù)量增多,存在高發(fā)的JAK2基因V617F點(diǎn)突變。這種突變與造血生長因子受體的活化及信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。JAK2基因V617F點(diǎn)突變能使紅細(xì)胞生成素受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體、血小板生成素受體等異?;罨?,使信號經(jīng)過由Janus激酶和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子組成的信號傳導(dǎo)途徑(JAK-STAT途徑)傳導(dǎo)時效應(yīng)增強(qiáng),促使紅系祖細(xì)胞異常增生以及粒系祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞系過度增生[4-5]。發(fā)生突變的干/祖細(xì)胞進(jìn)一步分化,在骨髓中粒、紅、巨三系有核細(xì)胞中可以有不同程度的表達(dá),在外周血中的成熟粒細(xì)胞上也有表達(dá)。由于存在少量突變克隆株的情況以及不同方法的敏感性差異的情況,實(shí)時熒光定量法檢測出JAK2基因V617F點(diǎn)突變的每個樣本的突變比例大致為10%~100%。梁國威等[6]報(bào)道TaqMan探針結(jié)合較低變性溫度下復(fù)合擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)的檢測下限為0.1%,敏感性高于常規(guī)的DNA直接測序法。高敏感的方法可以提高陽性檢出率,特別對于少量突變克隆株的檢測,但需要注意的是過于敏感的方法有可能會導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。

    MPD需要與其它繼發(fā)血細(xì)胞增多性疾病鑒別。本研究中,PV組與繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥組之間WBC、Hb、PLT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PV組骨髓象可見骨髓有核細(xì)胞增生明顯活躍,特別以紅系增生為顯著,粒系和巨核系也有不同程度的增生,與外周血細(xì)胞增多情況相符。而繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥骨髓象多無明顯異常增生的表現(xiàn),與其紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)增多和紅細(xì)胞代償性增生的致病原因相符。PV組JAK2基因V617F突變率達(dá)91.7%,明顯高于繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥組,與文獻(xiàn)報(bào)道[5]相近。在疾病早期外周血細(xì)胞數(shù)升高不明顯時,JAK2基因V617F突變和血清EPO水平檢測結(jié)合骨髓象有助于診斷。ET組PLT明顯高于繼發(fā)性血小板增多癥組(P<0.05),JAK2基因V617F突變率有50.0%,而ST組未見突變。對于未檢出突變的ET,結(jié)合骨髓象中巨核系形態(tài)特點(diǎn)有診斷意義。ET組表現(xiàn)為巨核細(xì)胞胞體較大,成熟明顯,PLT分布也明顯增多,常可見體積小或巨大、畸形PLT;而ST組多表現(xiàn)為PLT分布略增多,巨核細(xì)胞無明顯異常形態(tài)。李偉皓等[7]報(bào)道MPD患者的PLT、PLT壓積、PLT體積分布寬度高于ST患者,PLT平均體積低于ST患者,這與MPD的巨核細(xì)胞克隆性增殖本質(zhì)相關(guān)。兩類疾病PLT參數(shù)的變化情況也與本研究中ET組和ST組不同的PLT形態(tài)表現(xiàn)相符合。PMF組JAK2基因V617F突變率達(dá)到66.7%,但血細(xì)胞計(jì)數(shù)值與繼發(fā)性骨髓纖維化組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PMF組骨髓象可見粒系和巨核系增生較活躍、紅系增生較低,血涂片中淚滴狀紅細(xì)胞易見;而由慢性粒細(xì)胞白血病、骨髓轉(zhuǎn)移癌等原發(fā)病后期引發(fā)的繼發(fā)性骨髓纖維化骨髓象可見有明顯特征的白血病細(xì)胞或癌細(xì)胞。兩組間主要依靠骨髓和外周血細(xì)胞的形態(tài)特征結(jié)合JAK2基因V617F突變檢測來鑒別診斷。本研究MPD患者中有一系增高或二系增高的PV患者,JAK2基因V617F突變率較高的情況與葉選馨等[8]報(bào)道一致。但與該報(bào)道不同的是,本研究的MPD患者中有2例女性PV患者紅細(xì)胞和PLT數(shù)均見增高。因此,在MPD的JAK2基因V617F突變率與外周血增高程度相關(guān)性的方面需要進(jìn)一步的大樣本的研究。

    YHIM等[9]和BAKOSI等[10]研究發(fā)現(xiàn),在JAK2基因V617F點(diǎn)突變與臨床表現(xiàn)和血液學(xué)特征的關(guān)系上,ET和PMF患者中JAK2基因V617F突變者PLT、WBC數(shù)量高于未突變者,脾大更明顯,發(fā)生靜脈血栓幾率也較大,并且對羥基脲更敏感,而對非氯米喹酮則不敏感。對于突變陽性者,可選擇JAK2抑制劑的靶向治療。因此,JAK2基因V617F點(diǎn)突變檢測結(jié)合骨髓細(xì)胞形態(tài)以及血細(xì)胞數(shù)值綜合分析有助于MPD的診斷,為治療提供依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1]TEFFERI A, VARDIMAN JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms:the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms[J]. Leukemia, 2008,22(1):14-22.

    [2]LEVINE RL, WADLEIGH M, COOLS J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis[J].Cancer Cell,2005,7(4):387-397.

    [3]JAMES C, Ugo V, LE COUéDIC JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythemia vera[J].Nature,2005,434(7037):1144-1148.

    [4]MA W, KANTARJIAN H, ZHANG X, et al. JAK2 exon 14 deletion in patients with chronic myeloproliferative neoplasms[J].PLoS One,2010,5(8):e12165.

    [5]CAMPBELL PJ, GREEN AR. The myeloproliferative disorders[J].N Engl J Med,2006,355(23):2452-2466.

    [6]梁國威,邵冬華,曹清蕓,等.TaqMan探針結(jié)合COLD-PCR原理定量檢測JAK2V617F突變率研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(3):398-401.

    [7]李偉皓,劉永春,王彩云,等.血小板參數(shù)對血小板增生性疾病的鑒別診斷價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,24(1):57-59.

    [8]葉遠(yuǎn)馨,宋興勃,周易,等.BCR/ABL陰性骨髓增生性疾病患者JAK2-V617F點(diǎn)突變與外周血三系變化的相關(guān)性[J].中國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2012,29(5):582-586.

    [9]YHIM HY, KIM HS, SOHN JY, et al. JAK2 V617F-positive essential thrombocythemia in a patient with Klinefelter syndrome:a case report[J].Cancer Genet Cytogenet,2010,198(2):162-165.

    [10]BAROSI G,ROSTI V.Novel strategies for patients with chronic myeloproliferative disorders[J].Curr Opin Hematol, 2009,16(2):129-134.

    (本文編輯:范基農(nóng))

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