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    硫酸化辣木多糖的制備及其抗氧化活性研究

    2020-11-27 07:59:28許云華喬友志
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

    許云華,周 旋,喬友志

    (連云港師范高等專(zhuān)科學(xué)校海洋港口學(xué)院,江蘇,連云港 222006)

    辣木(Moringa oleifera Lam.),又名鼓植樹(shù)、山葵樹(shù),屬辣木科辣木屬植物。這是一種有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物,全株都有利用價(jià)值。辣木富含多種人體所需的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸、多糖、抗?fàn)I養(yǎng)因子、黃酮和多酚類(lèi)化合物及氨基酸,可以作為天然營(yíng)養(yǎng)食物材料。辣木不僅可以直接食用,而且經(jīng)過(guò)加工處理后還可以制成保健品。辣木富含植物多糖(Polysaccharide),而植物多糖具有降血糖、降血壓、降膽固醇,護(hù)心、護(hù)肝、治療潰瘍、抗炎抑菌、促進(jìn)凝血、抗腫瘤[1]等藥理作用,以及解熱、利尿、止疼、預(yù)防心臟病等功效。植物多糖作為一種保健食品已經(jīng)進(jìn)入人們的實(shí)際生活,如黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要的作用[2],因此辣木有非常廣闊的經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)前景。

    多項(xiàng)研究顯示,植物多糖經(jīng)分子修飾后,其抗氧化活性和藥理活性都有所增強(qiáng);經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后,其分子量的大小、空間結(jié)構(gòu)及取代基會(huì)發(fā)生改變。植物多糖的硫酸化修飾是植物多糖分子修飾中應(yīng)用較為廣泛的一種修飾方法,許多植物多糖經(jīng)過(guò)硫酸化修飾后不僅生物活性增強(qiáng),抗病毒、抗腫瘤、抗免疫缺陷的效能也大為提高[3-4]。Jaiswal 和Yassa 等人發(fā)現(xiàn)辣木葉的水提取物含有降血糖有效成分[5-6]。Satish 等人的實(shí)驗(yàn)表明,辣木在經(jīng)過(guò)熱水浸提后提取出的辣木多糖具有抗突變活性[7]。Choudhary 等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)辣木多糖具有抗?jié)冏饔肹8]。實(shí)驗(yàn)主要研究用熱水浸提取法提取辣木中的植物多糖,并對(duì)提取到的辣木粗多糖進(jìn)行硫酸化修飾,以研究其抗氧化活性。

    一、實(shí)驗(yàn)材料與所用設(shè)備

    (一)材料與試劑

    材料:辣木葉(產(chǎn)地為云南保山,云南廣昆堂農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

    試劑:無(wú)水乙醇,95%乙醇,100%三氯乙酸(TCA),氫氧化鈉,硫酸化試劑(正丁醇、硫酸銨、濃硫酸),硫酸鉀,鹽酸,氯化鋇,明膠,硫酸亞鐵,水楊酸,過(guò)氧化氫,Tris 鹽酸緩沖溶液(Tris-HCl),焦性沒(méi)食子酸。以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    (二)儀器與設(shè)備

    CPA225D 分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司),30B 萬(wàn)能粉碎機(jī)(無(wú)錫市中銀機(jī)械制造有限公司),XMTD-204 恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司),島津UV2550 分光光度計(jì)(日本島津有限公司),低速離心機(jī)LD5-10(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),90-2 磁力攪拌器(上海申勝生物技術(shù)有限公司),VERTEX70紅外光譜儀(德國(guó)BRUKER 公司),ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)CHRIST 公司)。

    二、實(shí)驗(yàn)方法

    (一)辣木多糖的提取

    將辣木葉置于烘箱內(nèi),以80 ℃干燥,粉碎后過(guò)40 目篩。采用熱水浸提法,稱(chēng)取500 g 辣木葉粉末,按料液比1∶20(g/mL)量取去離子水,置于燒杯中混合均勻,水浴溫度80 ℃下提取2 次后將提取液合并;采取真空濃縮,將提取液濃縮至原體積的1/5。采用TCA 法去蛋白,以1∶10 比例將100%的TCA 加入到樣品中,置于冰箱中冷藏沉淀1 h,離心取上清。醇沉后取上清液緩緩倒入95%乙醇,并且用玻璃棒緩緩攪拌,使乙醇濃度達(dá)到80%,經(jīng)過(guò)濾、離心、干燥即為辣木粗多糖[9]。

    (二)辣木多糖的硫酸化修飾

    在冰浴條件下,錐形瓶中加入硫酸化試劑充分?jǐn)嚢?。?.3 g 辣木多糖加入裝有硫酸化試劑的錐形瓶中,0 ℃條件下攪拌直至多糖充分溶解。用濃度為2.5 mol/mL 的氫氧化鈉調(diào)節(jié),使溶液顯中性(pH 值為7.0—8.0)。以離心法取沉淀加入透析袋透析,經(jīng)48 h后減壓濃縮體積,降低到原始體積的1/5。按照1∶3比例加入95%乙醇醇沉,然后取沉淀物以4000 r/min離心10 min,去除上清液,經(jīng)真空冷凍干燥即為硫酸化辣木多糖。

    (三)硫酸化辣木多糖的取代度測(cè)定

    采用硫酸鋇比濁法測(cè)定硫酸根離子含量[10]。分別吸 取0.02 mL、0.06 mL、0.10 mL、0.14 mL、0.18 mL、0.20 mL 的0.6 mg/mL 硫酸鉀溶液加入試管,用濃度為1 mol/L 鹽酸將六個(gè)試管補(bǔ)加至200 μl,再加入3%三氯乙酸3.8 mL 和0.5%氯化鋇明膠溶液1.0 mL后充分混勻,靜置10 min,在360 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值A(chǔ)1,用明膠溶液測(cè)吸光度值A(chǔ)2,使用(A1-A2)對(duì)硫酸根的質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    在100 ℃水浴下,用1 mol/L 鹽酸與硫酸化辣木多糖制備2 mg/mL 儲(chǔ)存液,4 ℃條件下保存,然后吸取0.2 mL 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定A1、A2。根據(jù)測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硫酸基含量(S)并計(jì)算取代度(DS)。取代度的計(jì)算式為:

    取代度(DS)=1.62×S/(32-1.02×S)

    (四)單因素實(shí)驗(yàn)

    固定稱(chēng)取辣木多糖0.3 g,取正丁醇3 mL。選取硫酸化制備反應(yīng)時(shí)間、濃硫酸體積和硫酸銨添加量作為制備硫酸化辣木多糖單因素實(shí)驗(yàn)的考察因素。

    1.反應(yīng)時(shí)間對(duì)辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取濃硫酸7.5 mL,硫酸銨用量為0.125 g,反應(yīng)時(shí)間分別為20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h,測(cè)定取代度。

    2.濃硫酸體積對(duì)辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取硫酸銨0.125 g,反應(yīng)時(shí)間為30 min,濃硫酸用量分別為2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL、12.5 mL,測(cè)定取代度。

    3.硫酸銨用量對(duì)辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取濃硫酸7.5 mL,反應(yīng)時(shí)間30 min,硫酸銨用量分別為0.1 g、0.125 g、0.150 g、0.175 g、0.20 g,測(cè)定取代度。

    (五)正交實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取硫酸化辣木多糖制備的反應(yīng)時(shí)間、濃硫酸用量、硫酸銨用量作為考察因素,以取代度為指標(biāo),選取L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

    表1 因素水平表

    (六)紅外光譜檢測(cè)

    利用最優(yōu)化條件制備硫酸化辣木多糖。分別取2 mg 辣木多糖和硫酸化辣木多糖,用研缽將多糖與溴化鉀充分研磨混合后壓片,在4000 cm-1—400 cm-1區(qū)間內(nèi)對(duì)辣木多糖和硫酸化辣木多糖進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)。

    (七)抗氧化活性測(cè)定

    取正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下制得的硫酸化辣木多糖,測(cè)定其抗氧化活性。

    1.羥基自由基(·OH)的清除率測(cè)定

    取4 個(gè)干凈的試管,分別加入濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL,再加入1 mL 的6 mmol/L 硫酸亞鐵,1 mL 的6 mmol/L水楊酸,最后加入1 mL 的6 mmol/L 過(guò)氧化氫啟動(dòng)反應(yīng),搖動(dòng)試管使溶液混合均勻。置于37 ℃水浴下反應(yīng)1 h,然后于510 nm 處測(cè)定不同濃度樣品及對(duì)照組吸光度值(對(duì)照組以蒸餾水代替多糖樣品溶液)[11]。對(duì)照組吸光度值記為Ai,樣品吸光度值記為Aj[12]。清除率計(jì)算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    2.超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率測(cè)定

    分別取濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL 加入到試管中,分別加入0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)4.0 mL,震蕩搖勻,然后置于25 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min;加入2.5 mmol/L 的焦性沒(méi)食子酸溶液0.4 mL,使內(nèi)容物混合均勻,置于25 ℃水浴條件下充分反應(yīng)3 min;再加入2 mol/L 鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)[13]。在325 nm 處測(cè)定吸光度,對(duì)照組吸光度值記為Ai,樣品吸光度值記為Aj[14]。清除率計(jì)算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    3.二苯代苦味?;杂苫―PPH·)的清除率測(cè)定

    取5 個(gè)試管,分別加入20μl、40μl、60μl、80μl、100 μl 濃度為1.01×10-1mg/mL 的DPPH·溶液,加多糖溶液至4 mL,充分混勻。樣品組:3.5 mL濃度為0.1 g/L二苯代苦味?;杂苫?0%乙醇溶液,0.5 mL樣品溶液。對(duì)照組:3.5 mL 濃度為0.1g/L 二苯代苦味?;杂苫?0%乙醇溶液,0.5mL 蒸餾水??瞻捉M:3.5 mL無(wú)水乙醇,0.5 mL 樣品溶液[15]。將樣品對(duì)應(yīng)溶液分別加入10 mL 試管中,密封,充分混勻,靜置30 min,于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度,空白對(duì)照組的吸光度值記為Ai,樣品溶液的吸光度值記為Aj[16]。清除率計(jì)算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    三、結(jié)果與分析

    (一)單因素實(shí)驗(yàn)

    1.硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

    繪制硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線,詳見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)回歸方程:y=1.2735x+0.0415;相對(duì)系數(shù):R2=0.9959。

    圖1 硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.反應(yīng)時(shí)間對(duì)硫酸化效果的影響

    隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,硫酸化辣木多糖的取代度顯著變大。反應(yīng)30 min 時(shí)硫酸化辣木多糖的取代度達(dá)到最大值,為0.56;反應(yīng)時(shí)間大于30 min 時(shí),取代度減?。ㄒ?jiàn)圖2)。數(shù)據(jù)表明,適當(dāng)增加反應(yīng)時(shí)間,取代度會(huì)增大,但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于30 min 時(shí),取代度會(huì)降低。這可能是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),造成一部分硫酸化多糖的硫酸基游離出來(lái)[17],導(dǎo)致取代度降低。因此,選擇最適合辣木多糖硫酸化反應(yīng)時(shí)間30 min,繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度影響

    3.濃硫酸體積對(duì)硫酸化效果的影響

    反應(yīng)開(kāi)始后,當(dāng)濃硫酸體積為2.5 mL 至7.5 mL時(shí),取代度呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃硫酸的體積為7.5 mL時(shí),取代度達(dá)到最高值,為0.413;當(dāng)濃硫酸體積超過(guò)7.5 mL 時(shí),取代度降低(見(jiàn)圖3)。原因可能是由于濃硫酸過(guò)多,多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞[17],導(dǎo)致取代度降低。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,濃硫酸的最適體積為7.5 mL。

    圖3 濃硫酸體積對(duì)取代度的影響

    4.硫酸銨用量對(duì)硫酸化效果的影響

    反應(yīng)開(kāi)始后,硫酸銨用量為0.1 g—0.125 g 時(shí),取代度呈上升趨勢(shì),當(dāng)硫酸銨添加量為0.125 g 時(shí),取代度達(dá)最大值0.631,繼續(xù)加大硫酸銨用量,取代度則下降(見(jiàn)圖4)。因此,硫酸銨的最佳添加量為0.125 mg。

    圖4 硫酸銨用量對(duì)取代度的影響

    (二)正交實(shí)驗(yàn)

    在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按表1 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 極差分析可知RC>RA>RB,即硫酸銨用量對(duì)辣木多糖的硫酸化影響最大,反應(yīng)時(shí)間和濃硫酸體積對(duì)硫酸基取代度的影響相對(duì)較小,最優(yōu)條件組合是A1B2C2,即硫酸化辣木多糖的制備反應(yīng)時(shí)間為30 min,濃硫酸加入量為7.5 mL,硫酸銨添加量為0.125 mg,在此條件下取代度為0.535。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    (三)紅外光譜檢測(cè)

    辣木多糖及硫酸化辣木多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)表征見(jiàn)圖5。在3450 cm-1出現(xiàn)O-H 伸縮針對(duì)吸收峰,羥基與濃硫酸發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致硫酸化辣木多糖在此處O-H 的羥基峰明顯減弱。與辣木多糖相比,硫酸化辣木多糖出現(xiàn)3 個(gè)新特征峰,在1240 cm-1和1150 cm-1處均形成了S=O 特征峰,C-O-SO3的伸縮振動(dòng)引起810 cm-1處出現(xiàn)特征峰,由此可初步判斷硫酸化修飾是成功的[18]。

    圖5 辣木多糖及硫酸化辣木多糖的紅外譜圖

    (四)抗氧化活性測(cè)定

    1.羥基自由基(·OH)的清除率

    隨著多糖溶液濃度的增大,清除率不斷提高,硫酸化辣木多糖對(duì)·OH 的最大清除率為79.8%,比未經(jīng)硫酸化多糖的最大清除率(56.29%)提高了23.51%(見(jiàn)圖6)。實(shí)驗(yàn)表明,硫酸化后的辣木多糖清除·OH的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

    圖6 羥基自由基(·OH)的清除率

    2.超氧陰離子自由基O2-·的清除率

    隨著多糖濃度升高,辣木多糖及硫酸化辣木多糖對(duì)O2-·的清除率逐漸增大。糖濃度為0.8 mg/mL 時(shí),硫酸化的辣木多糖對(duì)O2-·的清除率提高了33.32%(見(jiàn)圖7)。實(shí)驗(yàn)表明,硫酸化后的辣木多糖清除O2-·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

    圖7 超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率

    3.二苯代苦味?;杂苫―PPH·)清除率

    隨著多糖濃度的升高,辣木多糖和硫酸化辣木多糖對(duì)DPPH·清除率都增大,經(jīng)過(guò)硫酸化的辣木多糖對(duì)苯代苦味?;杂苫淖畲笄宄蕿?5.79%,比未硫酸化的多糖的最大清除率51.23%提高了14.56%(見(jiàn)圖8)。實(shí)驗(yàn)表明,硫酸化后的辣木多糖清除DPPH·的能力比辣木多糖稍有提高。

    圖8 DPPH·自由基清除率

    綜上,隨著多糖濃度的升高,硫酸化辣木多糖活性較辣木多糖增強(qiáng),可能是硫酸化修飾伸展了多糖的支鏈,致使多糖·OH 因暴露而改變了親水性,在水溶液中溶解度增強(qiáng),抗氧化活性也得到增強(qiáng)。邵力成等人[19]的研究表明,海洋真菌多糖硫酸化的活性隨著硫酸基取代度的增加而增強(qiáng),但王雁等人[20]的虎奶多糖研究表明,硫酸化多糖的取代度高,抗氧化活性不一定強(qiáng)。因此,硫酸化多糖的抗氧化活性不僅與取代度有關(guān),而且與硫酸基取代位置及其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。至于修飾多糖的位置以及空間構(gòu)象不明確等問(wèn)題,則有待進(jìn)一步研究。

    四、結(jié)論

    紅外譜圖對(duì)比表明,用濃硫酸、正丁醇以及硫酸銨作為硫酸化試劑,對(duì)辣木多糖進(jìn)行硫酸化結(jié)構(gòu)修飾是可行的。硫酸化辣木多糖制備最優(yōu)條件為:反應(yīng)時(shí)間30 min,濃硫酸體積7.5 mL,硫酸銨用量0.125 g,在此條件下硫酸化辣木多糖的取代度是0.535。經(jīng)過(guò)硫酸化后的辣木多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、二苯代苦味?;杂苫那宄识加忻黠@提高。可見(jiàn),硫酸化修飾可以增強(qiáng)辣木多糖的抗氧化活性。

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