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    硫酸化辣木多糖的制備及其抗氧化活性研究

    2020-11-27 07:59:28許云華喬友志
    關(guān)鍵詞:實驗

    許云華,周 旋,喬友志

    (連云港師范高等專科學(xué)校海洋港口學(xué)院,江蘇,連云港 222006)

    辣木(Moringa oleifera Lam.),又名鼓植樹、山葵樹,屬辣木科辣木屬植物。這是一種有獨特經(jīng)濟價值的熱帶植物,全株都有利用價值。辣木富含多種人體所需的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸、多糖、抗?fàn)I養(yǎng)因子、黃酮和多酚類化合物及氨基酸,可以作為天然營養(yǎng)食物材料。辣木不僅可以直接食用,而且經(jīng)過加工處理后還可以制成保健品。辣木富含植物多糖(Polysaccharide),而植物多糖具有降血糖、降血壓、降膽固醇,護心、護肝、治療潰瘍、抗炎抑菌、促進凝血、抗腫瘤[1]等藥理作用,以及解熱、利尿、止疼、預(yù)防心臟病等功效。植物多糖作為一種保健食品已經(jīng)進入人們的實際生活,如黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要的作用[2],因此辣木有非常廣闊的經(jīng)濟開發(fā)前景。

    多項研究顯示,植物多糖經(jīng)分子修飾后,其抗氧化活性和藥理活性都有所增強;經(jīng)過化學(xué)修飾后,其分子量的大小、空間結(jié)構(gòu)及取代基會發(fā)生改變。植物多糖的硫酸化修飾是植物多糖分子修飾中應(yīng)用較為廣泛的一種修飾方法,許多植物多糖經(jīng)過硫酸化修飾后不僅生物活性增強,抗病毒、抗腫瘤、抗免疫缺陷的效能也大為提高[3-4]。Jaiswal 和Yassa 等人發(fā)現(xiàn)辣木葉的水提取物含有降血糖有效成分[5-6]。Satish 等人的實驗表明,辣木在經(jīng)過熱水浸提后提取出的辣木多糖具有抗突變活性[7]。Choudhary 等在實驗中發(fā)現(xiàn)辣木多糖具有抗?jié)冏饔肹8]。實驗主要研究用熱水浸提取法提取辣木中的植物多糖,并對提取到的辣木粗多糖進行硫酸化修飾,以研究其抗氧化活性。

    一、實驗材料與所用設(shè)備

    (一)材料與試劑

    材料:辣木葉(產(chǎn)地為云南保山,云南廣昆堂農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

    試劑:無水乙醇,95%乙醇,100%三氯乙酸(TCA),氫氧化鈉,硫酸化試劑(正丁醇、硫酸銨、濃硫酸),硫酸鉀,鹽酸,氯化鋇,明膠,硫酸亞鐵,水楊酸,過氧化氫,Tris 鹽酸緩沖溶液(Tris-HCl),焦性沒食子酸。以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

    (二)儀器與設(shè)備

    CPA225D 分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司),30B 萬能粉碎機(無錫市中銀機械制造有限公司),XMTD-204 恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司),島津UV2550 分光光度計(日本島津有限公司),低速離心機LD5-10(北京醫(yī)用離心機廠),RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),90-2 磁力攪拌器(上海申勝生物技術(shù)有限公司),VERTEX70紅外光譜儀(德國BRUKER 公司),ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(德國CHRIST 公司)。

    二、實驗方法

    (一)辣木多糖的提取

    將辣木葉置于烘箱內(nèi),以80 ℃干燥,粉碎后過40 目篩。采用熱水浸提法,稱取500 g 辣木葉粉末,按料液比1∶20(g/mL)量取去離子水,置于燒杯中混合均勻,水浴溫度80 ℃下提取2 次后將提取液合并;采取真空濃縮,將提取液濃縮至原體積的1/5。采用TCA 法去蛋白,以1∶10 比例將100%的TCA 加入到樣品中,置于冰箱中冷藏沉淀1 h,離心取上清。醇沉后取上清液緩緩倒入95%乙醇,并且用玻璃棒緩緩攪拌,使乙醇濃度達到80%,經(jīng)過濾、離心、干燥即為辣木粗多糖[9]。

    (二)辣木多糖的硫酸化修飾

    在冰浴條件下,錐形瓶中加入硫酸化試劑充分攪拌。將0.3 g 辣木多糖加入裝有硫酸化試劑的錐形瓶中,0 ℃條件下攪拌直至多糖充分溶解。用濃度為2.5 mol/mL 的氫氧化鈉調(diào)節(jié),使溶液顯中性(pH 值為7.0—8.0)。以離心法取沉淀加入透析袋透析,經(jīng)48 h后減壓濃縮體積,降低到原始體積的1/5。按照1∶3比例加入95%乙醇醇沉,然后取沉淀物以4000 r/min離心10 min,去除上清液,經(jīng)真空冷凍干燥即為硫酸化辣木多糖。

    (三)硫酸化辣木多糖的取代度測定

    采用硫酸鋇比濁法測定硫酸根離子含量[10]。分別吸 取0.02 mL、0.06 mL、0.10 mL、0.14 mL、0.18 mL、0.20 mL 的0.6 mg/mL 硫酸鉀溶液加入試管,用濃度為1 mol/L 鹽酸將六個試管補加至200 μl,再加入3%三氯乙酸3.8 mL 和0.5%氯化鋇明膠溶液1.0 mL后充分混勻,靜置10 min,在360 nm 波長處檢測吸光度值A(chǔ)1,用明膠溶液測吸光度值A(chǔ)2,使用(A1-A2)對硫酸根的質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    在100 ℃水浴下,用1 mol/L 鹽酸與硫酸化辣木多糖制備2 mg/mL 儲存液,4 ℃條件下保存,然后吸取0.2 mL 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定A1、A2。根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硫酸基含量(S)并計算取代度(DS)。取代度的計算式為:

    取代度(DS)=1.62×S/(32-1.02×S)

    (四)單因素實驗

    固定稱取辣木多糖0.3 g,取正丁醇3 mL。選取硫酸化制備反應(yīng)時間、濃硫酸體積和硫酸銨添加量作為制備硫酸化辣木多糖單因素實驗的考察因素。

    1.反應(yīng)時間對辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取濃硫酸7.5 mL,硫酸銨用量為0.125 g,反應(yīng)時間分別為20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h,測定取代度。

    2.濃硫酸體積對辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取硫酸銨0.125 g,反應(yīng)時間為30 min,濃硫酸用量分別為2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL、12.5 mL,測定取代度。

    3.硫酸銨用量對辣木多糖硫酸化效果的影響

    固定取濃硫酸7.5 mL,反應(yīng)時間30 min,硫酸銨用量分別為0.1 g、0.125 g、0.150 g、0.175 g、0.20 g,測定取代度。

    (五)正交實驗

    根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取硫酸化辣木多糖制備的反應(yīng)時間、濃硫酸用量、硫酸銨用量作為考察因素,以取代度為指標(biāo),選取L9(34)正交表進行正交實驗(見表1)。

    表1 因素水平表

    (六)紅外光譜檢測

    利用最優(yōu)化條件制備硫酸化辣木多糖。分別取2 mg 辣木多糖和硫酸化辣木多糖,用研缽將多糖與溴化鉀充分研磨混合后壓片,在4000 cm-1—400 cm-1區(qū)間內(nèi)對辣木多糖和硫酸化辣木多糖進行紅外光譜檢測。

    (七)抗氧化活性測定

    取正交試驗最優(yōu)條件下制得的硫酸化辣木多糖,測定其抗氧化活性。

    1.羥基自由基(·OH)的清除率測定

    取4 個干凈的試管,分別加入濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL,再加入1 mL 的6 mmol/L 硫酸亞鐵,1 mL 的6 mmol/L水楊酸,最后加入1 mL 的6 mmol/L 過氧化氫啟動反應(yīng),搖動試管使溶液混合均勻。置于37 ℃水浴下反應(yīng)1 h,然后于510 nm 處測定不同濃度樣品及對照組吸光度值(對照組以蒸餾水代替多糖樣品溶液)[11]。對照組吸光度值記為Ai,樣品吸光度值記為Aj[12]。清除率計算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    2.超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率測定

    分別取濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL 加入到試管中,分別加入0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)4.0 mL,震蕩搖勻,然后置于25 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min;加入2.5 mmol/L 的焦性沒食子酸溶液0.4 mL,使內(nèi)容物混合均勻,置于25 ℃水浴條件下充分反應(yīng)3 min;再加入2 mol/L 鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)[13]。在325 nm 處測定吸光度,對照組吸光度值記為Ai,樣品吸光度值記為Aj[14]。清除率計算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    3.二苯代苦味?;杂苫―PPH·)的清除率測定

    取5 個試管,分別加入20μl、40μl、60μl、80μl、100 μl 濃度為1.01×10-1mg/mL 的DPPH·溶液,加多糖溶液至4 mL,充分混勻。樣品組:3.5 mL濃度為0.1 g/L二苯代苦味?;杂苫?0%乙醇溶液,0.5 mL樣品溶液。對照組:3.5 mL 濃度為0.1g/L 二苯代苦味?;杂苫?0%乙醇溶液,0.5mL 蒸餾水??瞻捉M:3.5 mL無水乙醇,0.5 mL 樣品溶液[15]。將樣品對應(yīng)溶液分別加入10 mL 試管中,密封,充分混勻,靜置30 min,于波長517 nm 處測定吸光度,空白對照組的吸光度值記為Ai,樣品溶液的吸光度值記為Aj[16]。清除率計算式為:

    清除率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100%

    三、結(jié)果與分析

    (一)單因素實驗

    1.硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

    繪制硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線,詳見圖1。標(biāo)準(zhǔn)回歸方程:y=1.2735x+0.0415;相對系數(shù):R2=0.9959。

    圖1 硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

    2.反應(yīng)時間對硫酸化效果的影響

    隨著反應(yīng)時間的增加,硫酸化辣木多糖的取代度顯著變大。反應(yīng)30 min 時硫酸化辣木多糖的取代度達到最大值,為0.56;反應(yīng)時間大于30 min 時,取代度減?。ㄒ妶D2)。數(shù)據(jù)表明,適當(dāng)增加反應(yīng)時間,取代度會增大,但反應(yīng)時間長于30 min 時,取代度會降低。這可能是由于反應(yīng)時間過長,造成一部分硫酸化多糖的硫酸基游離出來[17],導(dǎo)致取代度降低。因此,選擇最適合辣木多糖硫酸化反應(yīng)時間30 min,繼續(xù)后續(xù)實驗。

    圖2 反應(yīng)時間對取代度影響

    3.濃硫酸體積對硫酸化效果的影響

    反應(yīng)開始后,當(dāng)濃硫酸體積為2.5 mL 至7.5 mL時,取代度呈上升趨勢。當(dāng)濃硫酸的體積為7.5 mL時,取代度達到最高值,為0.413;當(dāng)濃硫酸體積超過7.5 mL 時,取代度降低(見圖3)。原因可能是由于濃硫酸過多,多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞[17],導(dǎo)致取代度降低。在這個實驗中,濃硫酸的最適體積為7.5 mL。

    圖3 濃硫酸體積對取代度的影響

    4.硫酸銨用量對硫酸化效果的影響

    反應(yīng)開始后,硫酸銨用量為0.1 g—0.125 g 時,取代度呈上升趨勢,當(dāng)硫酸銨添加量為0.125 g 時,取代度達最大值0.631,繼續(xù)加大硫酸銨用量,取代度則下降(見圖4)。因此,硫酸銨的最佳添加量為0.125 mg。

    圖4 硫酸銨用量對取代度的影響

    (二)正交實驗

    在單因素實驗的基礎(chǔ)上,按表1 進行正交實驗,結(jié)果見表2。由表2 極差分析可知RC>RA>RB,即硫酸銨用量對辣木多糖的硫酸化影響最大,反應(yīng)時間和濃硫酸體積對硫酸基取代度的影響相對較小,最優(yōu)條件組合是A1B2C2,即硫酸化辣木多糖的制備反應(yīng)時間為30 min,濃硫酸加入量為7.5 mL,硫酸銨添加量為0.125 mg,在此條件下取代度為0.535。

    表2 正交實驗結(jié)果

    (三)紅外光譜檢測

    辣木多糖及硫酸化辣木多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)表征見圖5。在3450 cm-1出現(xiàn)O-H 伸縮針對吸收峰,羥基與濃硫酸發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致硫酸化辣木多糖在此處O-H 的羥基峰明顯減弱。與辣木多糖相比,硫酸化辣木多糖出現(xiàn)3 個新特征峰,在1240 cm-1和1150 cm-1處均形成了S=O 特征峰,C-O-SO3的伸縮振動引起810 cm-1處出現(xiàn)特征峰,由此可初步判斷硫酸化修飾是成功的[18]。

    圖5 辣木多糖及硫酸化辣木多糖的紅外譜圖

    (四)抗氧化活性測定

    1.羥基自由基(·OH)的清除率

    隨著多糖溶液濃度的增大,清除率不斷提高,硫酸化辣木多糖對·OH 的最大清除率為79.8%,比未經(jīng)硫酸化多糖的最大清除率(56.29%)提高了23.51%(見圖6)。實驗表明,硫酸化后的辣木多糖清除·OH的能力遠遠高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

    圖6 羥基自由基(·OH)的清除率

    2.超氧陰離子自由基O2-·的清除率

    隨著多糖濃度升高,辣木多糖及硫酸化辣木多糖對O2-·的清除率逐漸增大。糖濃度為0.8 mg/mL 時,硫酸化的辣木多糖對O2-·的清除率提高了33.32%(見圖7)。實驗表明,硫酸化后的辣木多糖清除O2-·的能力遠遠高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

    圖7 超氧陰離子自由基(O2-·)的清除率

    3.二苯代苦味?;杂苫―PPH·)清除率

    隨著多糖濃度的升高,辣木多糖和硫酸化辣木多糖對DPPH·清除率都增大,經(jīng)過硫酸化的辣木多糖對苯代苦味?;杂苫淖畲笄宄蕿?5.79%,比未硫酸化的多糖的最大清除率51.23%提高了14.56%(見圖8)。實驗表明,硫酸化后的辣木多糖清除DPPH·的能力比辣木多糖稍有提高。

    圖8 DPPH·自由基清除率

    綜上,隨著多糖濃度的升高,硫酸化辣木多糖活性較辣木多糖增強,可能是硫酸化修飾伸展了多糖的支鏈,致使多糖·OH 因暴露而改變了親水性,在水溶液中溶解度增強,抗氧化活性也得到增強。邵力成等人[19]的研究表明,海洋真菌多糖硫酸化的活性隨著硫酸基取代度的增加而增強,但王雁等人[20]的虎奶多糖研究表明,硫酸化多糖的取代度高,抗氧化活性不一定強。因此,硫酸化多糖的抗氧化活性不僅與取代度有關(guān),而且與硫酸基取代位置及其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。至于修飾多糖的位置以及空間構(gòu)象不明確等問題,則有待進一步研究。

    四、結(jié)論

    紅外譜圖對比表明,用濃硫酸、正丁醇以及硫酸銨作為硫酸化試劑,對辣木多糖進行硫酸化結(jié)構(gòu)修飾是可行的。硫酸化辣木多糖制備最優(yōu)條件為:反應(yīng)時間30 min,濃硫酸體積7.5 mL,硫酸銨用量0.125 g,在此條件下硫酸化辣木多糖的取代度是0.535。經(jīng)過硫酸化后的辣木多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、二苯代苦味?;杂苫那宄识加忻黠@提高??梢姡蛩峄揎椏梢栽鰪娎蹦径嗵堑目寡趸钚?。

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