馬尾松β-蒎烯合酶基因克隆以及對松材線蟲侵染的響應

劉 彬，劉青華＊，周志春，羅 檸，解懿妮，陳獻志

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311400；

2. 浙江省臨海市自然資源和規(guī)劃局，浙江 臨海 317000)

馬尾松（Pinus massonianaLamb.）為松科（Pinaceae）松屬（PinusL.）常綠喬木，速生、耐旱，廣泛分布于我國亞熱帶地區(qū)，是我國速生豐產(chǎn)用材林和脂用林的先鋒樹種[1]。然而，馬尾松也經(jīng)受著多種病蟲害的侵襲，以松材線蟲病最為嚴重。松材線蟲病是一種由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer）Nickle; PWN）引起的毀滅性森林病害[2]，由于其致病力強，傳播速度快，導致全國馬尾松出現(xiàn)大面積死亡，截止到2018年，松材線蟲病已蔓延至18個省，超過500萬m3馬尾松林被松材線蟲侵襲[3]，生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴重破壞，造成巨大經(jīng)濟損失[4]。

萜類化合物是植物主要的次生代謝物質，釋放萜烯類化合物是植物應對多種生物與非生物脅迫最重要的防御措施之一[5]。松脂作為針葉樹種的主要防御物質，包含100多種單萜、倍半萜和二萜[6-8]，是針葉樹種抵御植食性昆蟲和病原體的重要屏障[9]。昆蟲脅迫或機械損傷會激活植物合成大量的烯萜類化合物，阻止病原體入侵或趨避入侵的昆蟲，從而起到物理防御以及化學防御作用[10-12]。已有研究表明，當云杉大墨天牛（Monochamus urussovi）入侵魚鱗云杉（Picea jezoensisCarr）時，導致其烯萜類化合物如α-蒎烯、3-蒈烯、β-蒎烯、異檸檬烯等含量顯著上升[13]。華山松（P. armandiiFranch.）的β-蒎烯含量較高，受到華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）入侵后，β-蒎烯的含量明顯上升[14]，表明β-蒎烯可能參與華山松抵御大小蠹的脅迫過程。當大冷杉（Abies grandisCraib）遭遇樹皮甲蟲侵食時，可誘導萜類化合物特別是β-蒎烯積累量增加[15]。此外，在油松（P. tabulaeformisCarr.）、白皮松（P. bungeanaZucc. et Endi）、雪松（Cedrus deodara(Roxburgh) G. Don）、金邊龍柏（Sabina chinensis(L.) Ant. cv. Aurea）、紅皮云杉（P. koraiensisNakai）的揮發(fā)性物質中，β-蒎烯為主要成分，具有明顯的抑菌作用[16]。

馬尾松為重要的脂用樹種，富含大量松脂。其中單萜化合物為松脂的主要成分，可以作為植保素對松材線蟲的入侵起到直接防御作用。作為馬尾松松脂的重要組成部分，α-蒎烯與β-蒎烯含量變化可直接影響松材線蟲的種群數(shù)量，受損傷的松樹體內(nèi)α-蒎烯與β-蒎烯含量均高于健康株系[17-19]。也有相關研究表明，α-蒎烯濃度與松材線蟲死亡率呈現(xiàn)正相關趨勢[20]；而β-蒎烯的抑菌作用高于α-蒎烯，β-蒎烯可通過影響受傷樹體的真菌藍變使松材線蟲種群密度減小[21]。賈洪敏等認為，馬尾松松脂中單萜類物質β-蒎烯、香葉烯、檸檬烯等可能與寄主抗性存在相關性[22]。在松材線蟲入侵后，高抗馬尾松中的β-蒎烯含量顯著高于易感馬尾松[23]。此外，α-蒎烯與β-蒎烯的比例可影響松材線蟲及其伴生菌的繁殖能力。Niu等[24]發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例可以影響松材線蟲的繁殖力，且較低濃度的單萜化合物可能抑制松材線蟲繁殖力。

單萜合酶可以通過催化底物牻牛兒基焦磷酸（GPP）合成單萜類物質，可直接或間接決定萜類化合物的含量以及多樣性。在受到食草動物取食后的陸地棉（Gossypium hirsutumLinn.）中，β/α蒎烯合酶GhTPS2表達量顯著上調，可參與植物的抗病過程[25]。病蟲害取食或機械損傷阿拉斯加云杉（P. sitchensis(Bong.) Carrière）可誘導創(chuàng)傷型樹脂道發(fā)育，促進單萜合酶基因PsTPS2表達量上調，PsTPS2可催化α蒎烯和β-蒎烯合成[11]。單萜合酶基因在針葉樹種的防御過程中極為重要[26]，而在馬尾松中萜類相關基因的研究較少，目前僅有馬尾松α-蒎烯合酶基因被克隆。本課題組前期高抗與易感馬尾松二代轉錄組測序結果顯示，β-蒎烯合酶基因為高抗馬尾松差異表達基因[27]，然而，由于缺乏基因的全長序列，限制了對β-蒎烯合酶基因的進一步研究。

本研究基于前期研究基礎，結合馬尾松三代全長轉錄組測序結果，首次克隆獲得PmPinScDNA全長序列，分析該基因的理化性質、系統(tǒng)發(fā)育以及接種松材線蟲后在高抗和易感馬尾松中的表達特征，并探究其產(chǎn)物對松材線蟲的抑制作用，為解析馬尾松抗病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自安徽省林業(yè)科學研究院馬尾松無性系試驗林。根據(jù)前期該院對試驗林內(nèi)無性系測定的松材線蟲病抗性指數(shù)，選擇高抗無性系‘休寧-5′（抗性指數(shù)4級）、易感無性系‘黃山-1’（抗性指數(shù)1級）各6株，各無性系均為4年生植株，生長狀況良好。松材線蟲試驗林設在安徽省林業(yè)科學研究院苗圃，位于安徽省合肥市（31°51′ N，117°10′ E），屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫15.7℃，年平均日照時數(shù)2 100 h，年平均降水量1 000 mm，全年無霜期228 d，四季分明，自然條件優(yōu)越。供試松材線蟲為高致病性株系‘廣株3B’ 和‘全4’混合株系，于灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌落上純培養(yǎng)，保存于4°C冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 松材線蟲培養(yǎng) 將灰葡萄孢接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，于28℃霉菌培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5 d。待白色菌落生長至培養(yǎng)皿上蓋處，將純化好的高致病性松材線蟲接種到灰葡萄孢菌落內(nèi)，于28℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)約9 d，使菌落被松材線蟲完全取食。進一步用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲，12 h后收集于10 mL離心管中，300 r·min-1離心5 min，去除上清液。將各離心管中的松材線蟲匯集并混勻，最終制備成每微升含50條松材線蟲的懸濁液[17]。

1.2.2 松材線蟲接種 于2017年7月，天氣較晴好，氣溫維持在30℃以上，選擇3株高抗和易感植株接種松材線蟲，每株選擇不同方向的5個枝條，每個枝條至少包含3個當年生嫩枝，在枝條的底端采用剝皮接種法：在選出的枝條底端一側割開長約5 cm的切口，剝皮時注意不能剝得太深，輕輕割入木質部即可，也不要使樹皮脫落，且用小鋸在切口上刮齒痕，以模擬天牛的咬食痕，同時防止松材線蟲溶液流出切面。將線蟲懸浮液均勻注入切口處，接種量為含有10 000頭線蟲的200 μL松材線蟲混濁液，對另外3株高抗和易感植株注入等量的蒸餾水作為對照。為保證線蟲成活，將切開的樹皮小心覆在傷口處。

1.2.3 樣品采集 所取樣品包括高抗馬尾松和易感馬尾松2種基因型，接種松材線蟲和接種蒸餾水2種處理，接種后1、15、30 d和2 a 4個取樣時間點，3個生物學重復。取樣部位為高抗與易感馬尾松接種點上部5 cm處側枝和接種2 a后可檢測出松材線蟲且生長狀況良好的高抗馬尾松根、莖、葉。取樣后迅速用錫箔紙包好，做好標記后立即放入液氮中，實驗室保存于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗。

1.3 PmPinS基因的克隆

取馬尾松高抗和易感無性系莖部組織立即放入液氮中速凍，研磨后利用RN38 EASY spin plus植物RNA快速提取試劑盒提取RNA。經(jīng)SuperScript? III First-Strand Synthesis System反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)全長轉錄組中的PmPinS序列設計引物PmPinS-F（5′-AT GGATTTAATATCTGTCTTACCG-3′）和PmPinS-R（5′-TTATAAAGGCACAGGTTCAAG-3′），分別以高抗和易感馬尾松cDNA為模板利用MCLAB高保真酶（Tsingke）擴增PmPinS的全長編碼區(qū)序列。PCR反應體系（50 μL）為：25 μL I-5? 2×High-Fidelity Master Mix，2 μLPmPinS-F (10 μmol·L-1)，2 μLPmPinS-R (10 μmol·L-1)，1 μL cDNA模板，20 μL ddH2O，反應程序為98℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，與pClone007 Blunt Vector（Tsingke）連接，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株，獲得陽性克隆后測序。

1.4 PmPinS基因的生物信息學分析

利用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析目的基因cDNA序列的開放閱讀框，并在blastx（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上對預測到的ORF序列和氨基酸序列進行保守結構域分析和序列鑒定。用ClustalX對高抗和易感馬尾松PmPinS的核苷酸和氨基酸序列進行多重序列比對[28]。利用ExPASyProtParam（http://expasy.org/tools/pi_tool.html）預測蛋白的理化性質；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構，ITASSER v4.3對蛋白質三級結構進行預測[29]；用ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）預測葉綠體轉運肽。

利用ClustalX軟件對PmPinS及其它物種的萜類合酶蛋白序列進行多序列比對。用MEGA 5軟件[30]以最大似然法中的JTT模型進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，bootstrap值設為1 000。

1.5 PmPinS對松材線蟲侵染的響應分析

分別提取高抗和易感馬尾松在松材線蟲侵染后1、15、30 d的莖部組織RNA，合成cDNA第一鏈。利用Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0)設計PmPinS實時定量PCR引物PmPinSRT-F（5′-ACCGTTGCATCTGATGATGA-3′）和PmPinS-RT-R（5′-ACGTTCACGGTAAGCGAGTT-3′）。以馬尾松Actin（transcription elongation factor 1）基因為內(nèi)參[31]，利用SYBR Premix Ex Taq（Takara）和QuantStudio 7熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行實時定量PCR分析。每個樣品進行3次生物學重復，3次技術重復。利用2-ΔΔCT方法計算PmPinS基因的相對表達量。用單因素方差分析計算不同組織中基因表達量的顯著性差異，P ＜ 0.05用*標記，P ＜ 0.01用**標記。

1.6 單萜類化合物對松材線蟲的影響

從高抗馬尾松樹體內(nèi)分離出有活性的松材線蟲，接種于長滿灰葡萄球菌的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過Bellman分離法[32]將分離出的松材線蟲分裝于2 mL離心管中，配制成1 mL含有200條松材線蟲的懸濁液。將α-蒎烯標準品（純度為97%）和β-蒎烯標準品（純度為98%）及其混合溶液以一定的濃度梯度分別施加于松材線蟲（表1），25℃條件下培養(yǎng)24 h[33]。以施加TritonX-100作為對照，3次技術重復。選取以上萜類物質處理后0.5、6、24 h為時間節(jié)點，利用ZEISS Imager A2光學顯微鏡（蔡司公司）觀察其活性并計算數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 PmPinS基因的克隆及理化性質分析

以馬尾松莖部cDNA為模板，擴增得到PmPinS基因序列（圖1）。PmPinS的全長編碼區(qū)為1 878 bp，ORF Finder分析顯示其完整開放閱讀框為1 878 bp，編碼625個氨基酸（Genbank登錄號：MT019965），PmPinS蛋白質分子式為C3201H4977N865O957S33，分子量為71.95 kD，等電點（pI）為5.74。對PmPinS氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其含有單萜合酶典型的N末端保守結構域和C末端保守結構域。N末端保守結構域中包括質體轉運肽和RR(X)8W保守基序，其中，RR(X)8W主要負責催化異構化-環(huán)化反應[34]。C末端保守結構域包括DDXXD和NSE/DTE保守基序，DDXXD參與二價金屬離子和水分子的結合，維持活性位點的穩(wěn)定[35]。對蛋白質二級、三級結構分析后發(fā)現(xiàn)，PmPinS中共有400個氨基酸（64.00%）參與形成α-螺旋，20個氨基酸（3.20%）參與形成延伸鏈，19個氨基酸（3.04%）參與形成β-轉角，186個氨基酸（29.76）參與形成無規(guī)則卷曲，表明PmPinS蛋白的二級結構以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主（圖2）。

表 1 體外施加松材線蟲萜類化合物濃度梯度 Table 1 Volatiles treated on the B. xylophilu in vitro

圖 1 馬尾松PmPinS基因擴增Fig. 1 PCR amplification of PmPinS

圖 2 PmPinS氨基酸序列分析Fig. 2 The sequence analysis of PmPinS

2.2 PmPinS多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ClustalX將馬尾松PmPinS與扭葉松（P.contortaDouglas ex Loudon）、北美云杉（P.pungensEngelm）、歐洲云杉（P. abies(Linn.) H.Karsten）的同源序列進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，其與PsPinS、PaPinS、PcPinS具有相似的保守結構域，均包含RR(X)8W、DDXXD和NSE/DTE保守基序（圖3），與PcPinS序列相似性達93.16%。馬尾松PmPinS與已報道的馬尾松α-蒎烯合成酶（AGW25369）蛋白序列相似性為73.85%。推測PmPinS蛋白可能與β-蒎烯合酶功能相似，參與植物合成β-蒎烯的生物合成途徑。

為進一步對PmPinS進行系統(tǒng)進化分析，選取北美云杉、挪威云杉（P. excelsa(Lam.) Link）、銀杏（Ginkgo bilobaLinn.）等裸子植物的TPS蛋白序列與PmPinS共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。進化分析結果表明：PmPinS位于馬尾松TPS-d1亞家族，負責裸子植物單萜生物合成，與北美云杉β-蒎烯合酶處于同一分支。據(jù)此可以推斷，PmPinS為單萜合酶，可能參與β-蒎烯的生物合成。

2.3 PmPinS對松材線蟲侵染的響應

圖 3 PmPinS氨基酸序列比對分析Fig. 3 The sequence alignment of PmPinS

圖 4 PmPinS系統(tǒng)進化分析Fig. 4 Phylogentic analysis of PmPinS

圖 5 松材線蟲接種后高抗和易感馬尾松PmPinS表達模式Fig. 5 Relative expression levels of PmPinS in resistant and susceptible P. massoniana inoculated B. xylophilus

為解析高抗和易感馬尾松蒎烯合酶對松材線蟲侵染的響應，對松材線蟲侵染1、15、30 d的高抗和易感馬尾松中的PmPinS表達模式進行實時定量分析（圖5）。從表達趨勢上分析，相對于接種蒸餾水的陰性對照，高抗和易感馬尾松的PmPinS表現(xiàn)出相反的表達模式。高抗馬尾松中，PmPinS在松材線蟲接種后呈現(xiàn)上升趨勢，接種后30 d時基因表達量為對照的3倍左右。截然相反的是，在易感馬尾松中，PmPinS只在接種松材線蟲1 d后檢測到表達量，且只為對照的0.4倍。從表達量上分析，在陰性對照中高抗和易感馬尾松PmPinS基因表達量相近，接種松材線蟲后，高抗馬尾松中的PmPinS顯著高于易感馬尾松PmPinS。

鑒于PmPinS在高抗馬尾松中的顯著高表達，作者延長接種后采樣的時間節(jié)點。從接種松材線蟲2 a體內(nèi)攜帶松材線蟲且正常生長發(fā)育的高抗馬尾松的根、莖、葉中提取RNA，反轉錄之后進行qRT-PCR，以接種蒸餾水的高抗馬尾松作為對照，探究PmPinS在高抗馬尾松不同組織中的表達模式。結果表明：與對照組相比，PmPinS在接種后的高抗馬尾松莖中的表達量特異性顯著上調（圖6）。由此可以初步得出：PmPinS在接種后的高抗馬尾松中的表達量顯著高于易感馬尾松，且在高抗馬尾松莖部組織特異性高表達，從而可進一步驗證PmPinS在馬尾松對松材線蟲的防御過程中起正向調控的作用。松材線蟲主要通過松墨天牛取食馬尾松莖入侵樹體，馬尾松莖部組織是合成富含萜類化合物的松脂的主要場所，而松脂是馬尾松重要的次生代謝物，同時也是重要防御物質。因此，PmPinS編碼的蛋白為β-蒎烯合酶，其表達量在高抗馬尾松莖中顯著上調表明該基因可能參與萜類化合物的合成，從而使松脂中萜類含量增加，進而有助于高抗馬尾松對松材線蟲的防御過程。

圖 6 接種2 a后高抗馬尾松不同組織PmPinS相對表達量分析Fig. 6 Analysis of relative expression of PmPinS in resistant P. massoniana after inoculated with PWN over 2 years

圖 7 單萜類化合物對松材線蟲的抑制作用Fig. 7 The inhibition of monoterpenes on PWN

2.4 萜類化合物對松材線蟲的抑制作用

經(jīng)多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，PmPinS為β-蒎烯合酶，可能參與松脂中α-蒎烯或β-蒎烯等單萜類化合物的合成。為檢測松脂中主要萜類化合物對松材線蟲的抑制作用，以馬尾松松脂化學組分的主要單萜類化合物組成和含量為參考[36]，其中，馬尾松松脂中α-蒎烯的平均含量約為170～200 mg·g-1，β-蒎烯平均含量約為5.0～13 mg·g-1。因此，本研究設置不同濃度梯度的稀釋液外源施加于體外培養(yǎng)的松材線蟲（表1），以探究單萜類化合物對松材線蟲的抑制作用。結果表明：與對照組相比，在α-蒎烯和β-蒎烯的單一溶液中，隨著化合物濃度和處理時間的增加，松材線蟲的平均存活率顯著降低（圖7）。α-蒎烯處理：濃度為500 mg·g-1處理0.5 h和濃度為150 mg·g-1處理24 h，松材線蟲存活率幾乎為零；β-蒎烯處理：實驗組任意濃度處理0.5 h和6 h時，松材線蟲平均存活率可被抑制50.00%，處理24 h時其抑制率可達90.00%（圖7）。萜類化合物混合溶液對松材線蟲的抑制作用顯著高于單一溶液。低濃度的混合溶液處理6 h后，松材線蟲存活率幾乎為零（圖7）。因此，初步得出結論：作為馬尾松松脂的主要成分，α-蒎烯和β蒎烯可抑制松材線蟲存活率。

3 討論

萜類化合物是生態(tài)系統(tǒng)中重要的次生代謝產(chǎn)物[37]，可介導植物與植物之間、植物與微生物之間以及植物與動物之間的相互作用，協(xié)調生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展[38]。此外，萜類化合物還可以作為植物防御劑來增強生態(tài)系統(tǒng)功能，協(xié)調相鄰植物、動物和微生物的生長、發(fā)育和繁殖[39]以及植物種群的形成和進化[40]。

據(jù)報道，植物萜類化合物能夠抑制細菌、真菌和病毒的感染[41]，且植物萜類各組分在抗菌方面具有協(xié)同作用[42]。油松、紅皮云杉中萜類化合物對細菌、真菌和放線菌生長影響的微生物實驗表明，松脂、松果提取物為50 mg·mL-1時可抑制放線菌生長，雪松提取物濃度為200 mg·mL-1時可抑制細菌和放線菌的生長，表明針葉樹種萜類化合物對微生物具有抑制作用。油松、白皮松、金邊龍柏中含有較高濃度的β-蒎烯，被認為是空氣微生物傳播的關鍵抑制劑，紅皮云杉和雪松中含有較少的β-蒎烯，對微生物的抑制作用較小[16]。因此，β-蒎烯在抑菌過程中發(fā)揮重要作用。然而，也有研究表明，萜類化合物也可能作為植食性昆蟲的引誘劑，且可以影響其覓食、產(chǎn)卵、尋找寄主等行為[43]。單萜化合物是馬尾松松脂的重要化學組分，可以作為植保素對植食性昆蟲的入侵起到直接防御作用[44]。α-蒎烯與β-蒎烯含量變化可直接導致松材線蟲種群數(shù)量的增加，使其更容易進入寄主體內(nèi)，且受損傷的松樹體內(nèi)α-蒎烯與β-蒎烯含量均高于健康株系[45-46]。也有相關研究表明，α-蒎烯濃度與松材線蟲死亡率呈現(xiàn)正相關趨勢[47]；而β-蒎烯的抑菌作用高于α-蒎烯，β-蒎烯可通過影響受傷樹體的真菌藍變使松材線蟲種群密度減小[48]。因此，β-蒎烯在針葉樹種抵御病原體入侵過程中發(fā)揮重要作用。

萜類合酶是萜類化合物合成過程中的關鍵酶，植物的萜類合酶可劃分為7個家族，即TPS-a-g?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)發(fā)育分析，TPS-d家族為裸子植物萜類合酶所特有，其中，單萜合酶（mono-TPS）、倍半萜合酶（sesqui-TPS）、二萜合酶（di-TPS）各聚為一個亞家族，分別為TPS-d1、TPS-d2、TPS-d3[49]。本研究克隆得到的β-蒎烯合酶基因，通過多序列以及系統(tǒng)進化樹分析，鑒定為TPS-d1亞家族成員，符合單萜合酶的典型結構特征。在針葉樹種中，單萜合酶最適反應條件為堿性, 且其酶活性催化需要金屬離子輔助[44]。裸子植物中的單萜合酶包含α和β結構域結構以及I類活性位點，在金屬離子的輔助下, 從而將GPP轉換成環(huán)狀或非環(huán)狀單萜[17,50]。裸子植物中不同的TPS基因序列的保守性高約為70%[51]，本研究獲得的β-蒎烯合酶基因，與馬尾松α-蒎烯合酶基因同源性為73.85%，與扭葉松β-蒎烯合酶基因同源性高達93.16%。

目前，已有20多種單萜合酶基因在針葉樹中報道[52]，而萜類合酶基因在參與各種生物與非生物脅迫方面的研究仍然較少。在被子植物中，也只有較少的研究表明食草性昆蟲可誘導與防御相關的TPS基因表達[53]。玉米（Zea maysL.）中倍半萜烯合酶基因的表達受甜菜夜蛾幼蟲（Spodoptera exiguaHuebner.）的攝食所誘導[54]。擬南芥中的白菜蝶（Pieris rapaeLinne.）幼蟲的取食導致AtTPS10基因的轉錄水平升高[55]，在玉米和花生的2個植物系統(tǒng)中，誘導的TPS基因表達均導致胡萜類化合物大量累積，間接參與防御過程[56-57]。在受蟲害侵食的大陸棉中，GhTPS1與GhTPS2表達量上調[25]。在針葉樹種中，有關TPS基因在針葉樹中表達以應對昆蟲襲擊的報道甚少。Hall等鑒定了扭葉松和樟子松（P. sylvestrisLinn.）中的α-蒎烯合酶以及β-蒎烯合酶基因及其功能[54]。大冷杉、挪威云杉和北美云杉受到機械損傷、MeJA處理或生物脅迫時，單萜合酶基因明顯上調[58]。在受到象鼻蟲（Pissodes strobePeck.）入侵的北美云杉中，單萜合酶基因的表達水平顯著上調[11]。海岸松（P.pinasterAiton）及意大利松（P. pineaL.）受到松材線蟲侵染時，（-）-蒎烯合酶基因顯著上調[35]。阿拉斯加云杉受到昆蟲取食后，其（-）-蒎烯合酶基因PsTPS2表達量顯著上調。通過對PsTPS2進行功能研究發(fā)現(xiàn)，PsTPS2可催化合成α-蒎烯與β-蒎烯，二者含量比例為35∶10，與在大冷杉中（-）-蒎烯合酶基因酶活產(chǎn)物（主要產(chǎn)物為α-蒎烯與β-蒎烯）相似，但比例（40∶60）略有差異[18]。α-蒎烯與β-蒎烯為阿拉斯加云杉松脂主要成分，在受到象鼻蟲取食2 a后，木質部中的α-蒎烯含量增加了3倍，β-蒎烯含量增加了2.3～6.3倍[11]。經(jīng)MeJA處理的挪威云杉和鉆傷的白云杉（P. glauca(Moench)Voss）中，α-蒎烯與β-蒎烯也可在莖中大量積累，與莖中的單萜合酶基因表達量上調相呼應[59]。同時表明，單一酶可同時形成2種或多種產(chǎn)物。鑒于針葉樹種單萜TPS合酶基因家族各成員之間的高度序列相關性，作者推斷馬尾松PmPinS或為多產(chǎn)物酶，可能催化α-蒎烯、β-蒎烯等萜類化合物。α-蒎烯和β-蒎烯為馬尾松松脂中主要的單萜化合物，其含量變化可能受到松材線蟲侵染所誘導。

本研究發(fā)現(xiàn)，以馬尾松松脂中α-蒎烯與β-蒎烯的濃度為參考，外源施加不同濃度的α-蒎烯、β-蒎烯及其混合溶液于松材線蟲，可明顯降低松材線蟲存活率，且混合溶液的抑制作用顯著高于單一溶液。Wang等[60]研究發(fā)現(xiàn)，利用熏蒸法對松材線蟲進行α-蒎烯處理，結果表明，隨著α-蒎烯濃度增加松材線蟲的死亡率增加。也有研究表明，對松材線蟲施加蒎烯等多種單萜化合物可降低松材線蟲活性[61]。β-蒎烯相對于α-蒎烯而言對藍變真菌表現(xiàn)出較強的抑制作用。藍變真菌為松材線蟲的主要食物來源，因此，β-蒎烯可間接抑制松材線蟲繁殖[61]。本研究結果與上述研究結果相似。然而，對于蒎烯類化合物對松材線蟲的影響也有不同觀點。Niu等[24]前期研究表明，α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例可以影響松材線蟲及其伴生藍變真菌的繁殖力。較低濃度的單萜化合物可能抑制松材線蟲繁殖力，而高濃度的單萜化合物可能提高松材線蟲的繁殖力。松材線蟲的繁殖力在α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比例為1∶0.8時較高，在α-蒎烯和β-蒎烯的濃度比為1∶0.1時較低。由此推斷，萜類化合物對松材線蟲的影響可能因各組分所占比例而有所差異。單萜合酶在不同植物、不同器官和組織部位中具有不同的功能[62-65]，許多基因具有組織特異性以及抵御逆境特異性的表達模式，有助于提高植物對于食草性動物或病原體防御能力[66]。本研究中，馬尾松β-蒎烯合酶PmPinS在接種后的高抗和易感馬尾松中表達量差異顯著，高抗馬尾松中該基因的表達量明顯高于易感馬尾松，且隨著接種時間增加而顯著上調，且在接種2 a后長勢良好但攜帶松材線蟲的高抗馬尾松莖部組織特異性高表達。由此說明，PmPinS基因可能參與了馬尾松對松材線蟲的防御過程，且具有正向調控作用。

4 結論

本研究首次從馬尾松中克隆獲得PmPinS基因，且對PmPinS基因的理化性質、蛋白結構、系統(tǒng)進化關系、響應松材線蟲侵染的表達模式以及α/β-蒎烯對松材線蟲的抑制作用進行了分析。PmPinS基因為單萜合酶家族的成員，可能參與β-蒎烯等單萜化合物的生物合成。接種松材線蟲后，PmPinS基因在高抗馬尾松中的表達量隨接種時間上調并顯著高于易感馬尾松，且在高抗馬尾松莖部組織特異性顯著高表達，初步表明該基因可能參與馬尾松對松材線蟲的防御過程。對松材線蟲外源施加PmPinS基因酶活產(chǎn)物α-蒎烯和β-蒎烯可顯著抑制松材線蟲存活率，證實PmPinS基因參與馬尾松對松材線蟲的防御過程，且對松材線蟲的活性具有抑制作用。該結果將有助于馬尾松抗松材線蟲機制的解析，并為馬尾松抗性品種的早期選擇和松材線蟲的有效防治奠定理論基礎。