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    優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響

    2020-11-27 10:47:34周建新邱偉芬
    食品科學(xué) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:黑曲霉黃曲霉青霉

    劉 慧,周建新,方 勇,邱偉芬

    (南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

    稻谷是我國(guó)主要的糧食作物,占全國(guó)糧食總量的40%[1]。儲(chǔ)藏階段的稻谷可能遭受各種微生物的污染,從而影響儲(chǔ)藏安全和食用品質(zhì),有些微生物在適宜條件下還會(huì)分泌毒素,對(duì)人類(lèi)健康和生命造成嚴(yán)重威脅[2]。霉菌由于其生長(zhǎng)對(duì)所需水分與溫度等條件的要求遠(yuǎn)比細(xì)菌、放線菌和酵母菌低,成為對(duì)稻谷危害最大的微生物,加之我國(guó)稻谷儲(chǔ)藏期長(zhǎng)及儲(chǔ)藏條件不夠完善,霉菌活動(dòng)對(duì)稻谷品質(zhì)造成嚴(yán)重影響[3-4]。目前已有不少學(xué)者對(duì)稻谷中霉菌的種類(lèi)及霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響進(jìn)行了研究[5-7],但是不同霉菌菌株對(duì)稻谷品質(zhì)影響差異的研究尚少。因此,本研究擬通過(guò)將分離自稻谷的不同霉菌菌株接種于無(wú)菌稻谷上,分析稻谷的霉菌生長(zhǎng)情況、品質(zhì)指標(biāo)及相關(guān)酶活力變化,探究不同霉菌菌株對(duì)稻谷品質(zhì)的影響,以確定對(duì)稻谷品質(zhì)影響較大的菌株從而進(jìn)行重點(diǎn)防控。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    秈稻(2017年收獲)采樣于湖南省衡陽(yáng)市角山米業(yè)有限責(zé)任公司。按照GB/T 5491—1985《糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法》,采用3 層、5 點(diǎn)取樣法,分別以糧倉(cāng)東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點(diǎn)作為取樣點(diǎn),每個(gè)取樣點(diǎn)分別在距糧堆表層0.5 m、中央層、距地面0.5 m取樣,樣品放置在無(wú)菌采樣袋中,于4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前將15 個(gè)點(diǎn)的樣品等量混合。

    高鹽察氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;淀粉酶測(cè)試盒、多酚氧化酶測(cè)試盒、過(guò)氧化物酶測(cè)試盒、植物丙二醛測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)試盒南京建成生物試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠;GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;CM-5色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司;JH-722s可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;101-3AS電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠;ELX800酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Tek公司。

    1.3 方法

    1.3.1 稻谷樣品中霉菌的分離純化與鑒定

    稻谷樣品中霉菌的分離純化參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》,選用高鹽察氏培養(yǎng)基,加入稻谷樣品稀釋液,在28 ℃下培養(yǎng)7 d,將獲得的菌株通過(guò)劃線分離培養(yǎng)法、三點(diǎn)法進(jìn)行分離純化培養(yǎng),得到純化菌株。將純化菌株進(jìn)行顯微觀察,拍攝其菌落、菌絲及孢子照片,對(duì)菌株進(jìn)行初步判斷。同時(shí)對(duì)得到的純化菌株提取DNA[8],以引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST對(duì)比。將鑒定過(guò)的菌株斜面培養(yǎng),用液體石蠟隔絕空氣[9]后,于4 ℃保存。

    1.3.2 稻谷輻照滅菌

    參照沈飛等[10]的方法,將稻谷樣品經(jīng)南京航空航天大學(xué)輻照中心60Co輻照(12 kGy)滅菌后裝入無(wú)菌塑料密封袋,4 ℃冷藏備用。

    1.3.3 霉菌孢子懸浮液制備

    參照張繼忠等[11]的方法,將蠟封保藏的菌株接種至新的斜面培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待霉菌生長(zhǎng)產(chǎn)生大量孢子,用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面,收集孢子懸浮液,置于三角瓶中振蕩10 min,再用無(wú)菌脫脂過(guò)濾除去營(yíng)養(yǎng)菌體。將得到的孢子懸浮液,按照GB/T 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》統(tǒng)計(jì)不同霉菌孢子懸浮液濃度,并用無(wú)菌水調(diào)節(jié)懸浮液濃度至約1×108CFU/mL[12],4 ℃冷藏備用。

    1.3.4 稻谷樣品霉菌接種

    無(wú)菌環(huán)境下,稱(chēng)取每份約10 g的滅菌稻谷樣品,置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,用移液槍精確移取0.1 mL霉菌孢子懸浮液均勻接種于樣品上,充分漩渦使其均勻分布。接種完畢后,參照楊基漢[13]、付消費(fèi)[14]等的方法,并結(jié)合采樣糧庫(kù)的實(shí)際儲(chǔ)藏環(huán)境,將處理過(guò)的樣品置于30 ℃、相對(duì)濕度85%環(huán)境中進(jìn)行儲(chǔ)藏。分別在第2、4、6、8、10天取樣檢測(cè)。

    1.3.5 霉菌菌落直徑的測(cè)定

    參照文獻(xiàn)[15]燕麥培養(yǎng)基的制備方法,將稻谷磨粉后過(guò)篩,取稻谷粉60 g,溶于600 mL蒸餾水中,制成勻漿,加熱至45~50 ℃。再取瓊脂12.5 g,溶于400 mL水中,與稻谷粉勻漿混合后,121 ℃滅菌90 min。滅菌結(jié)束將稻谷培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,待其凝固后,用移液槍準(zhǔn)確移取10 μL霉菌懸浮液于平板中央,置于28 ℃培養(yǎng)箱中,48 h后開(kāi)始測(cè)量菌落直徑,測(cè)量間隔為12 h。測(cè)定兩條垂直的菌落直徑,以這兩垂直直徑的平均值作為菌落直徑[15]。

    1.3.6 稻谷霉菌計(jì)數(shù)

    參照GB 4789.15—2016,選用高鹽察氏培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)7 d后對(duì)稻谷霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    1.3.7 色度的測(cè)定

    使用CM-5色差儀對(duì)霉菌菌落進(jìn)行色度測(cè)定,為減小誤差帶來(lái)的影響,每組樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定,取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.3.8 稻谷脂肪酸值測(cè)定

    稻谷脂肪酸值測(cè)定參照GB/T 15684—2015《谷物碾磨制品 脂肪酸值的測(cè)定》。

    1.3.9 稻谷丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶活力測(cè)定

    利用相應(yīng)試劑盒測(cè)定稻谷樣品的丙二醛含量和淀粉酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物活力,其中酶活力結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 組平行,采用JMP 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和t檢驗(yàn),采用Origin 2017軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 稻谷樣品中霉菌的形態(tài)學(xué)與基因鑒定結(jié)果

    形態(tài)學(xué)主要觀察菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等,使用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察菌絲與孢子的形態(tài)[16]。將分離純化的霉菌菌屬進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,同時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序,結(jié)果如表1所示[17-18]。經(jīng)過(guò)霉菌形態(tài)學(xué)對(duì)比和測(cè)序,確定稻谷樣品中的主要霉菌屬有黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、桔青霉(Penicillium citrinum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和島青霉(Penicilliumsp. MF555)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他研究人員對(duì)稻谷霉菌區(qū)系調(diào)查結(jié)果[19-22]一致,即稻谷在儲(chǔ)藏過(guò)程中,優(yōu)勢(shì)霉菌為黃曲霉、黑曲霉等曲霉屬和產(chǎn)黃青霉、桔青霉等青霉屬。

    2.2 稻谷霉菌菌落直徑與接種稻谷霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果

    表1 稻谷中主要可培養(yǎng)霉菌菌屬鑒定結(jié)果Table 1 Identification of main cultivable fungi isolated from rice

    圖1 不同霉菌菌株在稻谷培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig. 1 Growth of different mold strains in rice medium

    稻谷樣品中不同霉菌在稻谷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)趨勢(shì)和菌落直徑變化分別如圖1A、B所示。由圖1可以看出,不同霉菌菌株在稻谷培養(yǎng)基中快速增長(zhǎng),表明稻谷是曲霉屬和青霉屬良好的生長(zhǎng)基質(zhì)。不同霉菌菌落的增長(zhǎng)速率與菌落直徑之間存在差異,以黑曲霉菌落直徑增長(zhǎng)最快,菌落直徑最大,其次是黃曲霉、米曲霉、土曲霉,青霉屬菌落直徑增長(zhǎng)速率相對(duì)于曲霉屬較為緩慢,以島青霉最為遲緩,表明曲霉屬在稻谷中的污染范圍較青霉屬更快更大。

    圖2 接種不同菌株的稻谷霉菌數(shù)量變化Fig. 2 Changes in number of different inoculated mold strains on rice

    稻谷霉菌量與是否發(fā)生霉變及霉變的程度有關(guān),霉菌量在3.0(lg(CFU/g))以下時(shí),稻谷處于未霉變狀態(tài),在3.0~7.0(lg(CFU/g))時(shí)處于霉變狀態(tài),超過(guò)7.0(lg(CFU/g))時(shí)霉變已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重[23]。實(shí)驗(yàn)選取霉變狀態(tài)稻谷以探究不同霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)與相關(guān)酶活力的影響。如圖2所示,對(duì)接種不同霉菌孢子懸浮液2 d后的稻谷樣品進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)霉菌菌落總數(shù)均在6.012~6.350(lg(CFU/g))之間,說(shuō)明接種成功。不同菌株接種于稻谷樣品后,霉菌便開(kāi)始快速增殖,樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌菌株的增長(zhǎng)速率之間存在差異,以黃曲霉和黑曲霉繁殖速率最快,儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了2.029、1.960(lg(CFU/g)),其次是米曲霉和島青霉,繁殖速率較慢的是桔青霉和產(chǎn)黃青霉,儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了0.620(lg(CFU/g))和0.770(lg(CFU/g))。

    2.3 接種稻谷樣品主要品質(zhì)變化

    2.3.1 色度的變化

    圖3 接種不同菌株的稻谷外觀和色度變化Fig. 3 Changes in appearance and color parameters of rice inoculated with different strains

    L*值代表明度,ΔL*為正表示偏白,為負(fù)表示偏暗;b*值代表褐變程度,Δb*為正表示黃色,為負(fù)表示藍(lán)色[24.25]。由圖3可知,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),稻谷顏色逐漸加深,至儲(chǔ)藏第4天,霉菌菌落開(kāi)始覆蓋稻谷表面,儲(chǔ)藏至第10天時(shí),黃曲霉、黑曲霉、米曲霉幾乎將稻谷表面全部覆蓋,土曲霉和青霉屬菌株菌落覆蓋稻谷表面面積較小,這與不同菌株菌落直徑的測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),稻谷L*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),這是因?yàn)榍箤俸颓嗝箤倬暝谏L(zhǎng)初期會(huì)先長(zhǎng)出白色菌絲,導(dǎo)致稻谷表面明度上升[26]。儲(chǔ)藏末期,接種黑曲霉的稻谷表面L*值下降至66.33,在接種稻谷中亮度最低,其次是黃曲霉和米曲霉,分別為71.64和72.28,土曲霉和青霉屬菌株由于自身顏色和菌落生長(zhǎng)較慢,對(duì)稻谷表面明度影響較小。除接種黑曲霉的稻谷外,接種其他霉菌的稻谷b*值呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì),說(shuō)明稻谷表面顏色逐漸向黃褐色轉(zhuǎn)變,至儲(chǔ)藏末期,接種黃曲霉的稻谷表面褐變最嚴(yán)重,b*值達(dá)到了21.39,其次是米曲霉,達(dá)到了17.01,接種土曲霉和青霉屬菌株的稻谷表面褐變程度相近,b*值在16.23左右。

    2.3.2 脂肪酸值的變化

    圖4 接種不同菌株的稻谷脂肪酸值變化Fig. 4 Changes in fatty acid value of rice inoculated with different strains

    稻谷中的脂類(lèi)通過(guò)氧化降解為游離脂肪酸,一般來(lái)說(shuō)脂肪酸值越高,稻谷品質(zhì)越差[27]。由圖4可知,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),接種菌株后的稻谷脂肪酸值呈先上升后下降的趨勢(shì)。在儲(chǔ)藏第6天,脂肪酸值達(dá)到最高,其中接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值最高,達(dá)到了346.78 mg/100 g,其次是接種黃曲霉的稻谷(252.7 mg/100 g),接種土曲霉、米曲霉和青霉的稻谷脂肪酸值為100 mg/100 g。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是前期脂類(lèi)物質(zhì)大量水解成游離脂肪酸,后期脂肪酸氧化成酮、醛等物質(zhì)的速度加快,導(dǎo)致脂肪酸值降低[28]。在整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中,接種黑曲霉的稻谷脂肪酸值上升最快,其次是黃曲霉,接種桔青霉的稻谷脂肪酸值略高于米曲霉,脂肪酸值變化最小的是接種土曲霉的稻谷。在儲(chǔ)藏末期,脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷,為148.93 mg/100 g,其次是接種黃曲霉的稻谷,為118.48 mg/100 g,接種米曲霉、桔青霉、土曲霉、產(chǎn)黃青霉和島青霉的稻谷脂肪酸值均下降至100 mg/100 g以下。

    2.3.3 丙二醛含量的變化

    如圖5所示,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),稻谷丙二醛含量持續(xù)增加,儲(chǔ)藏前期稻谷丙二醛含量增加較慢,儲(chǔ)藏8 d后,丙二醛含量快速增加,增加趨勢(shì)呈現(xiàn)“前慢后快”的特點(diǎn),一方面可能是因?yàn)閮?chǔ)藏后期細(xì)胞氧化損傷不斷積累,膜脂過(guò)氧化程度嚴(yán)重,細(xì)胞逐漸裂解[29];另一方面,經(jīng)過(guò)儲(chǔ)藏前期的積累,稻谷中存在大量脂肪酸,氧化后導(dǎo)致丙二醛含量快速增加[30]。儲(chǔ)藏末期,接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高,為108.82 nmol/g,其次是接種黃曲霉的稻谷,丙二醛含量為96.47 nmol/g,接下來(lái)依次是接種島青霉、桔青霉、產(chǎn)黃青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

    圖5 接種不同菌株的稻谷丙二醛含量變化Fig. 5 Changes of malondialdehyde content in rice inoculated with different strains

    2.4 接種稻谷樣品酶活力變化

    圖6 接種不同菌株的稻谷淀粉酶活力變化Fig. 6 Changes in amylase activity in rice inoculated with different strains

    2.4.1 淀粉酶活力的變化

    淀粉酶活力影響稻谷的食用品質(zhì),其降低會(huì)導(dǎo)致淀粉黏度下降[31]。由圖6可知,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),淀粉酶活力不斷下降,這可能是因?yàn)樯矬w受到生物或非生物脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除動(dòng)態(tài)平衡被破壞,過(guò)多的自由基會(huì)攻擊細(xì)胞蛋白、DNA和膜結(jié)構(gòu),使得淀粉酶活力降低[32]。至儲(chǔ)藏末期,接種島青霉的稻谷淀粉酶活力最低,為0.000 7 U/mg,其次是接種土曲霉的稻谷(0.004 9 U/mg),接下來(lái)依次是接種產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、桔青霉、米曲霉、黃曲霉的稻谷。

    圖7 接種不同菌株的稻谷多酚氧化酶活力變化Fig. 7 Changes in polyphenol oxidase activity in rice inoculated with different strains

    2.4.2 多酚氧化酶活力的變化

    多酚氧化酶會(huì)引起稻谷發(fā)生酶促褐變,催化內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化成黑色素,導(dǎo)致稻谷表面顏色不斷加深[33-34]。由圖7可知,隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),各組稻谷多酚氧化酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),這與自由基積累有關(guān)。儲(chǔ)藏末期,接種黃曲霉的稻谷多酚氧化酶活力最低(2.444 U/mg),其次是接種米曲霉的稻谷(4.000 U/mg),接下來(lái)依次是接種黑曲霉、土曲霉、島青霉、產(chǎn)黃青霉和桔青霉的稻谷。

    2.4.3 過(guò)氧化氫酶活力的變化

    圖8 接種不同菌株的稻谷過(guò)氧化氫酶活力變化Fig. 8 Changes in catalase activity in rice inoculated with different strains

    過(guò)氧化氫酶是生命體內(nèi)酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)的主要物質(zhì),可以催化H2O2生成水和氧氣[35-36]。由圖8可知,稻谷接種霉菌菌株后,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基不能被及時(shí)清除,導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、DNA和膜結(jié)構(gòu)被攻擊,使得過(guò)氧化氫酶活力不斷下降。在儲(chǔ)藏末期,接種黃曲霉的稻谷過(guò)氧化氫酶活力最低(0.014 U/mg),其次是接種黑曲霉的稻谷(0.181 U/mg),接下來(lái)依次是接種產(chǎn)黃青霉、桔青霉、島青霉、米曲霉和土曲霉的稻谷。

    3 結(jié) 論

    經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)和基因鑒定,發(fā)現(xiàn)湖南稻谷中主要的可培養(yǎng)霉菌菌種為黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、桔青霉(Penicillium citrinum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和島青霉(Penicilliumsp. MF555)。在這7 種菌株中,黃曲霉與黑曲霉對(duì)稻谷產(chǎn)生相對(duì)更大的劣變影響,其中接種這兩種菌的稻谷儲(chǔ)藏10 d后菌落總數(shù)分別增加了2.029、1.960(lg(CFU/g)),且?guī)缀鯇⒌竟缺砻嫒扛采w,而儲(chǔ)藏末期,接種黃曲霉的稻谷褐變最為嚴(yán)重。在儲(chǔ)藏末期,脂肪酸值最高的是接種黑曲霉的稻谷(148.93 mg/100 g),其次是接種黃曲霉的稻谷(118.48 mg/100 g),接種黑曲霉的稻谷丙二醛含量最高(108.82 nmol/g),其次是接種黃曲霉的稻谷(96.47 nmol/g)。至儲(chǔ)藏末期,島青霉對(duì)稻谷淀粉酶活力影響最大,第10天時(shí)只有0.000 7 U/mg。而對(duì)多酚氧化酶影響最大的是黃曲霉,儲(chǔ)藏到第10天僅為2.444 U/mg。在儲(chǔ)藏末期,對(duì)稻谷過(guò)氧化氫酶影響最大的也是黃曲霉和黑曲霉,儲(chǔ)藏10 d時(shí)酶活力分別為0.014 U/mg和0.181 U/mg。根據(jù)前研究結(jié)果表明,黃曲霉和黑曲霉是稻谷儲(chǔ)藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株,且本實(shí)驗(yàn)證明了這兩種菌株對(duì)稻谷品質(zhì)影響較大,因此在未來(lái)有關(guān)儲(chǔ)糧安全的研究中,應(yīng)該更加關(guān)注對(duì)于曲霉屬,特別是對(duì)黃曲霉和黑曲霉的防控。本實(shí)驗(yàn)僅研究了單個(gè)菌株在嚴(yán)重霉變情況下對(duì)稻谷品質(zhì)的影響,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)以此為基礎(chǔ),繼續(xù)探究不同污染程度的多種優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響及防控優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)于稻谷儲(chǔ)藏安全的意義,以便更加明確優(yōu)勢(shì)霉菌對(duì)稻谷的影響。

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