鐵皮石斛多糖對2型糖尿病小鼠降糖降脂的作用

王云威，王景雪

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，我國的糖尿?。ㄓ绕涫?型糖尿病）患病率呈明顯的上升趨勢，糖尿病已成為腫瘤、心血管疾病之外的又一大慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病一般表現(xiàn)為高血糖癥狀，其病因是胰島β細胞分泌功能發(fā)生障礙，從而造成患者體內脂肪、蛋白質和碳水化合物代謝紊亂，加大了患者心血管疾病等并發(fā)癥的發(fā)病概率[2]。古典醫(yī)書記載了對糖尿病“養(yǎng)陰生津，平衡陰陽”的主要醫(yī)治方法[3]?，F(xiàn)代西醫(yī)主要是通過服用降糖藥物（二甲雙胍、阿卡波糖等）或注射胰島素來降低血糖治療糖尿病。

隨著人們生活質量以及對醫(yī)療水平要求的提高，降低糖尿病治療過程的痛苦已經成為廣大糖尿病患者的迫切訴求。因此，從中草藥中尋找高效、安全的預防和治療糖尿病天然產物，具有很高的實際應用價值?，F(xiàn)在已經有大量的研究發(fā)現(xiàn)，許多中草藥都有降低血糖水平的作用，其中包括生芪[4]、地黃[5]、黃連[6]、當歸[7]、葛根[8]、鐵皮石斛等。鐵皮石斛具有的藥用價值，是一種珍貴的藥材[9]，其最主要的藥用成分是石斛多糖，除此之外還含有石斛堿、黃酮和一些微量元素[10-13]。諸多研究證明鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗衰老和提高免疫力等藥理作用[14-16]。湯志遠等證明從鐵皮石斛莖提取物中分離得到的多糖具有降血糖的作用[17]。宓文佳等證明鐵皮石斛根提取物中分離得到的多糖也具有良好的降血糖的療效[18]，鐵皮石斛膏、鐵皮石斛當歸復方提取液在2型糖尿病小鼠降糖方面也具有顯著效果[19-20]。本實驗以鐵皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharide，DOP）為單味藥，研究其對糖尿病小鼠降糖降脂的作用，為鐵皮石斛多糖及其制劑用于治療糖尿病提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡ICR小鼠，雄性，體質量（20±3）g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（晉）2015-0001；使用正常小鼠飼料飼喂小鼠，飼料購買于山西醫(yī)科大學實驗動物中心；所有實驗動物均飼養(yǎng)于（24±2）℃的恒溫恒濕室內。

鐵皮石斛由山西省農業(yè)科學院溫室實驗房種植，取其莖用于多糖提取。

鹽酸二甲雙胍片 天津太平洋制藥有限公司；胰島素 南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 北京索萊寶公司；四氧嘧啶、戊巴比妥鈉 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BXM-50VE型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；GA-3型血糖儀 深圳三諾生物傳感股份有限公司；AR124CN型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；LGJ-1ON型超低溫冰箱 北京亞星儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病小鼠模型的建立及分組

選取體質量（25±3）g的健康純系ICR小鼠100 只，適應性飼養(yǎng)1 周，然后全部禁食不禁水24 h后，從中隨機選取10 只腹腔注射生理鹽水作為正常組，其余90 只小鼠按100 mg/kg mb的劑量腹腔注射四氧嘧啶溶液，每隔1 d注射一次，共注射3 次。之后正常飼喂3 d后，禁食12 h后用血糖儀進行尾部采血統(tǒng)計血糖濃度，以空腹血糖濃度不低于11.1 mmol/L為2型糖尿病模型成功標準。

從成模小鼠中隨機選出50 只小鼠，然后隨機分成5 組，每組10 只，腹腔注射生理鹽水的作為正常對照組，苦味酸進行標記，分組及灌胃給藥情況如下：高劑量給藥組（DOP-H）（造模成功的糖尿病小鼠灌胃450 mg/kg mbDOP）、中劑量給藥組（DOP-M）（造模成功的糖尿病小鼠灌胃300 mg/kg mbDOP）、低劑量給藥組（DOP-L）（造模成功的糖尿病小鼠灌胃150 mg/kg mbDOP）、模型對照組（造模成功的糖尿病小鼠灌胃等量生理鹽水）、陽性對照組（造模成功的糖尿病小鼠灌胃250 mg/kg mb鹽酸二甲雙胍溶液）、正常對照組（正常飼養(yǎng)未進行造模的小鼠灌胃等量生理鹽水）。每日早上8∶30定時給藥，灌胃時以0.1 mL/10 g mb為標準進行灌胃，每天一次，連續(xù)灌胃給藥4 周。

1.3.2 鐵皮石斛多糖提取率及含量測定

1.3.2.1 鐵皮石斛多糖的制備

鐵皮石斛多糖的制備按照邱現(xiàn)創(chuàng)等[21]的工藝流程制備。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取400.0 mg干燥至恒質量的葡萄糖，加入適量去離子水溶解后，轉移至100 mL容量瓶定容。取1 mL于50 mL的容量瓶中稀釋并定容，配成質量濃度為0.08 mg/mL的葡萄糖標準溶液。依次吸取質量濃度為0.08 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL和1.8 mL于干燥試管中，分別用去離子水補至2.0 mL，然后再加入體積分數(shù)5%的苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）1.0 mL和5.0 mL濃硫酸。搖勻振蕩，置于室溫下20 min后于490 nm波長處測定其吸光度。以2.0 mL去離子水按同樣量加入苯酚和濃硫酸為空白。以葡萄糖質量濃度ρ/（mg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為A＝13.952ρ-0.043 2（R2＝0.999 1）。

1.3.2.3 鐵皮石斛多糖提取率測定

鐵皮石斛多糖提取率按式（1）計算。

1.3.2.4 鐵皮石斛多糖質量分數(shù)測定

本實驗采用苯酚-硫酸法測定鐵皮石斛多糖質量分數(shù)，并按式（2）計算。

式中：0.91表示多糖的校正系數(shù)。

1.3.3 鐵皮石斛多糖的分離純化及紫外光譜分析

1.3.3.1 鐵皮石斛多糖溶液蛋白質的去除

利用Sevag法進行鐵皮石斛多糖脫蛋白。向鐵皮石斛多糖溶液中加入Sevag試劑（氯仿和正丁醇的體積比為4∶1，多糖溶液和Sevag試劑的體積比為5∶1，磁力攪拌器攪拌40 min，4 000 r/min離心20 min除去蛋白層，重復上述操作，直到蛋白質除盡為止。

1.3.3.2 鐵皮石斛多糖溶液脫色素

按照0.2 g/100 mL的量加入活性炭，60 ℃脫色1.5 h，除去鐵皮石斛多糖溶液中的色素。

1.3.3.3 鐵皮石斛多糖進行纖維素凝膠樹脂DEAE-52洗脫純化

稱取經除蛋白、脫色后的粗多糖300 mg，然后加入10 mL的蒸餾水溶解，待溶解完全后經0.45 μm的微孔濾膜過濾以備上樣。上樣量為300 mg/10 mL，流速為1 mL/min，先以去離子水洗脫，然后以0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L的氯化鈉溶液作為洗脫劑進行梯度洗脫，等量接收（5.0 mL/管）。用苯酚硫酸顯色法，并在490 nm波長處測定吸光度。可按吸光度將洗脫液分別收集為5 個部分（分別記為鐵皮石斛多糖洗脫l～5），并分別對其進行減壓濃縮、凍干。對氯化鈉溶液洗脫下來的鐵皮石斛多糖洗脫1～5進行脫鹽處理。去離子水將其分別溶解后，用透析袋以流水進行透析48 h，再將其減壓冷凍干燥得到無鹽的鐵皮石斛多糖洗脫1～5。

1.3.4 小鼠體質量記錄與空腹血糖濃度測定

實驗期間每7 d記錄小鼠體質量，統(tǒng)計小鼠體質量變化趨勢。分別于給藥第1、2、3、4周，各組小鼠禁食不禁水12 h后尾部取血，用血糖儀測定血糖濃度。

1.3.5 小鼠血脂指標檢測

實驗結束后采用摘除眼球法取小鼠血清，送至武漢塞維爾生物科技公司檢測胰島素、尿素氮、肌酐、糖化血清蛋白、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density liptein cholesterol，LDL-C）水平及T-AOC。

1.3.6 血糖-時間曲線下面積和胰島素敏感指數(shù)計算

整個實驗結束前1 d進行小鼠糖耐量實驗，小鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈采血測空腹血糖濃度，給藥15 min后，按照2 g/kg mb劑量腹腔注射質量分數(shù)10%的葡萄糖溶液，然后分別于30、60、120 min后尾靜脈采血測定血糖濃度。

1.3.6.1 血糖-時間曲線下面積計算

血糖-時間曲線下面積（area under curve，AUC）計算參照文獻[18]進行，AUC按式（3）計算。

式中：BG0為0 h的血糖濃度/（mmol/L）；BG1為1 h的血糖濃度/（mmol/L）；BG2為2 h的血糖濃度/（mmol/L）。

1.3.6.2 胰島素抵抗指數(shù)計算

根據(jù)測定的空腹血糖和空腹胰島素含量，按式（4）計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment was applied to assess the status of insulin resistance，HOMA-IR）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 2型糖尿病小鼠建模結果

在90 只小鼠建模過程中，驚厥死亡3 只，11 只小鼠空腹血糖濃度未達到成模水平，最后建模成功率為84.4%。

2.2 鐵皮石斛多糖提取率和質量分數(shù)測定結果

精確稱取10 g鐵皮石斛粉，按照1.3.2.1節(jié)的方法進行鐵皮石斛多糖的提取，最后得到鐵皮石斛粗多糖2.123 g，鐵皮石斛多糖的提取率為21.23%。

苯酚-硫酸法顯色后，在490 nm波長處測定分離純化后鐵皮石斛多糖溶液的吸光度，代入標準曲線回歸方程A＝13.952ρ-0.043 2（R2＝0.999 1）計算鐵皮石斛多糖樣品的多糖質量分數(shù)，所得到的鐵皮石斛粗多糖質量分數(shù)為46.75%。

2.3 鐵皮石斛多糖紫外光譜分析結果

紫外光譜分析結果如圖1所示，經分離純化后的鐵皮石斛多糖在210 nm波長附近出現(xiàn)多糖具有的特征吸收峰（最大吸收峰），且在260 nm和280 nm波長處無明顯吸收峰，表明分離純化鐵皮石斛多糖中幾乎不含有核酸和蛋白質等雜質。

圖1 鐵皮石斛多糖紫外光譜分析結果Fig. 1 Ultraviolet spectroscopic analysis of Dendrobium candidum polysaccharides

2.4 鐵皮石斛多糖對小鼠體質量的影響

表1 鐵皮石斛多糖對糖尿病小鼠體質量的影響（n＝ 10）Table 1 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on body mass of diabetic mice (n= 10)

由表1可知，造模成功后小鼠體質量與正常組小鼠相比體質量減輕，經鹽酸二甲雙胍和鐵皮石斛灌胃治療的2型糖尿病小鼠體質量呈現(xiàn)增長趨勢，而無治療的2型糖尿病小鼠體質量一直呈現(xiàn)下降趨勢。在整個實驗結束時，未治療的2型糖尿病小鼠的體質量明顯低于正常組小鼠以及經鹽酸二甲雙胍和鐵皮石斛灌胃治療的2型糖尿病小鼠體質量。

2.5 鐵皮石斛多糖對小鼠空腹血糖和糖化血清蛋白濃度的影響

糖化血清蛋白因受環(huán)境作用較小，所以能夠穩(wěn)定地反映機體過去1～2 周內的血糖水平[22]，而空腹血糖濃度則能實時反映機體血糖水平，但易受外界環(huán)境干擾。

表2 鐵皮石斛多糖對糖尿病小鼠空腹血糖濃度和糖化血清蛋白濃度的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on fasting blood glucose and glycated serum protein in diabetic mice (n = 10)

由表2可知，與模型組小鼠相比，鐵皮石斛多糖灌胃組小鼠空腹血糖濃度和糖化血清蛋白濃度均顯著降低（P＜0.05）。由表2中也可看出，鐵皮石斛多糖高劑量組與鹽酸二甲雙胍組的降糖效果基本一致。以上結果表明鐵皮石斛多糖具有明顯的降糖效果。

2.6 鐵皮石斛多糖對小鼠血清肌酐和尿素氮濃度的影響

作為糖尿病中常見的并發(fā)癥——糖尿病腎病嚴重損傷了患者的腎臟，給患者帶來了極大病痛，且極易造成糖尿病患者的病亡[23-24]。已有研究證明，因糖尿病引起的早期腎臟病變可用機體的血清尿素氮和肌酐來進行輔助診斷[25-26]。

表3 鐵皮石斛多糖對糖尿病小鼠血清尿素氮、肌酐濃度的影響（n＝ 10）Table 3 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on serum ureanitrogen and creatinine levels in diabetic mice (n= 10)

由表3可知，模型組小鼠的血清肌酐、尿素氮極顯著高于正常組小鼠（P＜0.01）。鐵皮石斛多糖灌胃組小鼠血清肌酐、尿素氮濃度與模型組小鼠相比均顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量效應。鐵皮石斛多糖高劑量組對2型糖尿病小鼠血清肌酐和尿素氮濃度的降低效果與鹽酸二甲雙胍效果基本一致，表明鐵皮石斛多糖能夠改善糖尿病小鼠的腎臟損傷。

2.7 鐵皮石斛多糖對小鼠血脂代謝的影響

表4 鐵皮石斛多糖糖尿病小鼠血脂代謝的影響（n＝ 10）Table 4 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on lipid metabolism in diabetic mice (n= 10)

糖尿病患者一般都患有嚴重的脂質代謝紊亂癥狀，長期嚴重的脂質代謝紊亂極大地增加了冠心病并發(fā)癥的幾率，從而給患者帶來了極大的健康威脅。由表4可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠TC、TG、LDL-C濃度極顯著增高（P＜0.01），HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01）。鐵皮石斛多糖高劑量組對2型糖尿病小鼠血脂代謝紊亂的改善效果與鹽酸二甲雙胍的效果基本一致。以上結果表明鐵皮石斛多糖可以改善糖尿病小鼠血脂代謝異常。

2.8 鐵皮石斛多糖對小鼠糖耐量、胰島素水平、胰島素抵抗性的影響

表5 鐵皮石斛多糖對糖尿病小鼠糖耐量、胰島素水平和胰島素抵抗性的影響（n＝ 10）Table 5 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on glucose tolerance, insulin content and insulin resistance in diabetic mice (n= 10)

由表5可知，模型組給予葡萄糖前后各時間點的血糖濃度及AUC均極顯著高于正常組，糖耐量異常（P＜0.01）。與模型組比較，灌胃4 周后，鐵皮石斛多糖高、中劑量組給予葡萄糖前后各時間點的血糖濃度及AUC均顯著降低（P＜0.05）。表明鐵皮石斛多糖能夠改善糖尿病小鼠的糖耐量異常狀況。與正常組相比，模型組小鼠胰島素水平極顯著降低（P＜0.01），而模型組小鼠胰島素抵抗性極顯著增高（P＜0.01）。與模型組小鼠相比，鐵皮石斛多糖高、中劑量組小鼠的胰島素水平均顯著提高（P＜0.05），而胰島素抵抗性均顯著降低（P＜0.05）。鐵皮石斛多糖高劑量組對2型糖尿病小鼠胰島素含量和胰島素抵抗性的改善與鹽酸二甲雙胍的效果基本一致。以上結果表明鐵皮石斛多糖可以提高2型糖尿病小鼠胰島素水平和降低糖尿病小鼠胰島素抵抗性。

2.9 鐵皮石斛多糖對小鼠肝臟、胰腺抗氧化酶活性及T-AOC的影響

表6 鐵皮石斛多糖對糖尿病小鼠SOD、CAT活力和T-AOC的影響（n＝ 10）Table 6 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on SOD and CAT activity and T-AOC in diabetic mice (n= 10)

由表6可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力和T-AOC極顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠相比，鐵皮石斛多糖灌胃小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力T-AOC均得到極顯著提高（P＜0.01），呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應。以上結果表明鐵皮石斛多糖可以提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化水平。

3 討 論

當今一些不良的飲食、作息習慣導致糖尿病發(fā)病率愈發(fā)大眾化和年輕化，其中2型糖尿病占到90%以上[27]。目前，對于糖尿病的治療主要是采用西藥降糖和注射胰島素的方法，長期注射胰島素給患者帶來了很大的痛苦，因此開發(fā)具有降糖降脂作用的功能型保健品，對于糖尿病的輔助治療具有重要的實踐意義。

本實驗結果表明：1）鐵皮石斛多糖對2型糖尿病小鼠具有良好的降糖效果，其中鐵皮石斛多糖高劑量的降糖效果與鹽酸二甲雙胍降糖效果基本一致。這一研究結果與湯志遠[17]、李秀芳[28]等研究結果一致。2）鐵皮石斛多糖對2型糖尿病小鼠的血脂代謝紊亂也具有良好的改善效果，與模型組小鼠相比，鐵皮石斛多糖高劑量組小鼠的LDL-C、TC、TG水平明顯降低，而HDL-C水平增加。張文等[29]利用猴頭菌粉多糖和李新萍等[30]利用山藥多糖灌胃糖尿病小鼠，也發(fā)現(xiàn)相應多糖具有明顯的降脂作用。3）糖耐量實驗和胰島素抵抗指數(shù)評價結果表明鐵皮石斛多糖能夠提高糖尿病小鼠對葡萄糖的耐受力，增加糖尿病小鼠血清胰島素水平和降低胰島素抵抗指數(shù)。腎功能檢測結果表明高劑量的鐵皮石斛多糖能夠極顯著地降低糖尿病小鼠血清肌酐和尿素氮濃度（P＜0.01），從而改善糖尿病小鼠的腎臟的損傷情況，這與穿心蓮、姜黃素對2糖尿病引起的腎臟病變具有一定的治療作用的結果基本一致[31-32]。

研究表明，氧化應激是導致胰島β細胞功能衰退的重要因素，氧化應激導致活性氧和活性氮產生過多，其中活性氧可直接損傷β細胞[33-34]。CAT能夠降低生物體內過氧化氫的水平，從而減少自由基和過氧化脂質的形成。SOD能夠把有害的超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫，進而在CAT的作用下轉化為對生物體無危害作用的水[35-36]。小鼠肝臟和胰腺抗氧化性酶活力測定結果表明，鐵皮石斛多糖能夠極顯著提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力和T-AOC（P＜0.01），從而增強清除自由基的能力和降低活性氧的產生，發(fā)揮抗氧化應激，修復肝臟和胰腺氧化損傷的作用。這說明抗氧化應激是鐵皮石斛多糖提高胰島素含量和緩解胰島素抵抗，從而抗糖尿病的原因。?；荻Y等[37]研究表明，鐵皮石斛多糖能夠抑制氧化應激狀態(tài)導致的JNK信號通路激活，從而保護胰島細胞免受氧化應激損傷。

綜上所述，本實驗以四氧嘧啶誘導的ICR2型糖尿病小鼠為材料，研究了鐵皮石斛降糖降脂作用。結果表明：鐵皮石斛多糖提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化能力的作用、具有良好的降糖降脂作用、增加糖尿病小鼠血清胰島素水平和降低胰島素抵抗指數(shù)、改善糖尿病小鼠的癥狀，這為鐵皮石斛多糖用于輔助治療糖尿病提供了一定的藥理學依據(jù)。