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    不同高級結(jié)構(gòu)墨西哥海參巖藻聚糖硫酸酯調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的構(gòu)效關(guān)系

    2020-11-27 10:47:24李雪靜常耀光王靜鳳
    食品科學(xué) 2020年21期
    關(guān)鍵詞:構(gòu)象分化多糖

    郭 垚,符 萌,李雪靜,王 娜,常耀光,王靜鳳

    (中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003)

    肥胖是一種全身性代謝性疾病,體內(nèi)脂肪過多積累會導(dǎo)致壽命縮短以及罹患II型糖尿病、心血管疾病等一系列健康問題[1-3]。脂肪組織在肥胖的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,研究表明,脂肪組織中脂肪細(xì)胞數(shù)目過多和體積過大則會導(dǎo)致肥胖[4-5]。因此調(diào)控脂肪細(xì)胞分化對改善肥胖及其引起的代謝疾病至關(guān)重要。

    多糖生物活性的發(fā)揮依賴于它們的結(jié)構(gòu)特征。近期研究發(fā)現(xiàn),高級結(jié)構(gòu)特征中的分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象與多糖的功能發(fā)揮密切相關(guān)。袁松[6]發(fā)現(xiàn),低分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯預(yù)防酒精性胃潰瘍的效果優(yōu)于高分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯;Sun Liqin等[7]對不同分子質(zhì)量(6~1 000 kDa范圍)紫球藻多糖的抗腫瘤和免疫活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,最小分子質(zhì)量(6.53 kDa)的多糖具有最強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性。Kojima[8]和Falch[9]等發(fā)現(xiàn)裂褶多糖和香菇多糖抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的實現(xiàn)依賴于其三股螺旋結(jié)構(gòu),當(dāng)該螺旋被破壞時,相應(yīng)的生物活性也隨之降低或消失。

    海參巖藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan,SC-FUC)是海參體壁中的重要活性成分[10]。大量研究表明,SC-FUC具有抗炎[11]、抗凝血[12]、改善胰島素抵抗[13]、改善飲酒導(dǎo)致的肝損傷[14]、抗腫瘤[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]等多種生理功能。目前已有研究證明海參硫酸多糖可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化過程[17],但關(guān)于SC-FUC高級結(jié)構(gòu)與其抑脂活性相關(guān)性的研究鮮見報道,因此研究不同高級結(jié)構(gòu)SC-FUC對脂肪細(xì)胞分化的影響具有深遠(yuǎn)意義。

    本實驗以3T3-L1細(xì)胞為研究對象,在體外水平對不同高級結(jié)構(gòu)墨西哥海參巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan from Holothuria mexicana,Hm-FUC)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的活性進(jìn)行比較研究并探討其作用機(jī)制,以期為SC-FUC活性的高效利用及其在功能食品領(lǐng)域的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    Hm-FUC由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院常耀光教授提供。

    D M E M 培養(yǎng)基 美國G i b c o 公司;胎牛血清以色列Biological Industries公司;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、地塞米松(dexamethasone,Dex)、胰島素、油紅O染料美國Sigma公司;乳酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;RNeasy Mini Kit 德國Qiagen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 日本Takara公司;SYBR Green熒光染料瑞士Roche公司;基因引物序列 上海生工有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HF 90型CO2培養(yǎng)箱 香港Heal Force公司;DL-CJ-IN型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;IX51型倒置顯微鏡 日本Olympus公司;680型酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司;Nano 200型微量分光光度計 杭州奧神儀器有限公司;LightCycler 96 Instrument實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 瑞士Roche公司。

    1.3 方法

    1.3.1 Hm-FUC結(jié)構(gòu)分析

    參照續(xù)曉琪[18]的方法分析4 種Hm-FUC(Hm1、Hm2、Hm3、Hm4)的高級結(jié)構(gòu)。

    1.3.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性測定

    將細(xì)胞按2×103個/孔接種于96 孔板中,細(xì)胞貼壁24 h后,在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度(0、20、40、80 μg/mL)的Hm1、Hm2、Hm3和Hm4,分別孵育24、48 h,采用MTT法測定細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞的相對增殖率按式(1)計算。

    1.3.3 LDH活力測定

    3)國家農(nóng)機(jī)補貼目錄中對于同樣用途的提水設(shè)備,不分成本大小給予同樣比例的補貼,可能不利于成熟機(jī)組的推廣應(yīng)用。

    細(xì)胞接種及加樣方法同1.3.1節(jié)。3T3-L1細(xì)胞經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4作用48 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,使用試劑盒測定上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活力。

    1.3.4 油紅O染色及細(xì)胞分化率計算

    將細(xì)胞按2×104個/孔接種于24 孔板中,待細(xì)胞融合后接觸抑制48 h,采用“傳統(tǒng)雞尾酒”法進(jìn)行誘導(dǎo)分化。于第0天添加受試物(Hm1、Hm2、Hm3和Hm4質(zhì)量濃度均為60 μg/mL),每2 d更換培養(yǎng)基,分化至第8天進(jìn)行油紅O染色,于顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

    采用比色法對細(xì)胞中脂肪含量進(jìn)行半定量檢測。每孔中加入800 μL異丙醇,充分吹打混勻,于490 nm波長處測定OD值。細(xì)胞分化率按式(2)計算。

    1.3.5 mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

    細(xì)胞接種、誘導(dǎo)分化及加樣方法同1.3.4節(jié)。采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取RNA,取1 μg RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以所得cDNA為模板,采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。以β-actin作為內(nèi)參,基因相對表達(dá)量以目的基因表達(dá)量/β-actin表達(dá)量表示,引物序列見表1。

    表1 脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes related to adipocyte differentiation

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    實驗結(jié)果以 ±s表示,使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Hm-FUC結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

    Hm-FUC原糖及其低分子質(zhì)量多糖的重均分子質(zhì)量(Mw)、均方根旋轉(zhuǎn)半徑(Rg)、水合半徑(Rh)等分子特征和鏈構(gòu)象參數(shù)如表2所示。Hm1、Hm2和Hm3均為無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象,且隨著重均分子質(zhì)量降低,多糖鏈逐漸變短變?nèi)犴?;Hm4為球形鏈構(gòu)象。

    表2 不同高級結(jié)構(gòu)Hm-FUC的重均分子質(zhì)量、分子尺寸和鏈構(gòu)象參數(shù)Table 2 Molecular masses and chain conformational parameters of Hm-FUCs with different advanced structures

    2.2 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響

    圖1 Hm-FUC 對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響Fig. 1 Effect of Hm-FUCs on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

    增殖是脂肪細(xì)胞分化必經(jīng)的一個重要階段[19]。為研究Hm-FUC對3T3-L1細(xì)胞增殖活性的影響,采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞增殖曲線結(jié)果如圖1所示,Hm-FUC可顯著抑制3T3-L1細(xì)胞的生長,且隨著時間延長和受試物劑量增加,抑制效果逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)出明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)受試物質(zhì)量濃度為80 μg/mL時,經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4處理48 h,3T3-L1前脂肪細(xì)胞的存活率分別下降了14.88%、18.38%、18.46%和13.47%(P<0.01)。結(jié)果表明,4 種Hm-FUC均可顯著抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖活性,其中Hm2和Hm3效果較好。

    圖2 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細(xì)胞LDH活力的影響Fig. 2 Effect of Hm-FUCs on LDH activity of 3T3-L1 preadipocytes

    為進(jìn)一步評估H m-F U C 的細(xì)胞毒性,檢測了3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的活力。如圖2所示,分別與Hm1、Hm2、Hm3和Hm4共孵育后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的活力均無顯著變化,表明Hm-FUC可以顯著抑制3T3-L1細(xì)胞增殖活性,但不造成細(xì)胞損傷。綜合MTT實驗與LDH活力分析結(jié)果,本研究選取60 μg/mL作為受試物質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

    2.3 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

    圖3 Hm-FUC對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響Fig. 3 Effect of Hm-FUCs on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

    油紅O可以特異性結(jié)合甘油三酯[20]。染色結(jié)果如圖3所示,經(jīng)誘導(dǎo)分化后,對照組中近90%脂肪細(xì)胞可與油紅O染料結(jié)合,表明3T3-L1細(xì)胞分化率高;而Hm-FUC對脂肪細(xì)胞的分化成熟有明顯的抑制作用,受試物組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量減少,其中Hm3效果尤為顯著。油紅O半定量結(jié)果進(jìn)一步證明了上述結(jié)果,經(jīng)Hm1、Hm2、Hm3和Hm4處理后,3T3-L1細(xì)胞的分化率分別下降了9.14%、20.05%、21.15%和8.73%(P<0.05,P<0.01)。上述結(jié)果表明,4 種Hm-FUC均可不同程度地抑制3T3-L1細(xì)胞分化,其中Hm3(210 kDa,無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象)活性最強(qiáng)。

    2.4 Hm-FUC對脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子mRNA表達(dá)的影響

    圖4 Hm-FUC對脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes related to adipocyte differentiation in 3T3-L1 preadipocytes

    C/EBPα、PPARγ和SREBP1c是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21-22]。由圖4可知,與對照組相比,Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著下調(diào)C/EBPα、PPARγ和SREBP1c的表達(dá),表明4 種Hm-FUC均可以抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá),且低分子質(zhì)量Hm-FUC優(yōu)于高分子質(zhì)量原糖,其中Hm3效果最優(yōu)。

    2.5 Hm-FUC對經(jīng)典Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

    圖5 Hm-FUC對Wnt/β-catenin通路上游關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes in Wnt/β-catenin signaling pathway in 3T3-L1 preadipocytes

    Wnt/β-catenin信號通路是負(fù)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的經(jīng)典通路[23]。如圖5所示,Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)膜受體Frz以及LRP5/6輔助受體的表達(dá)(P<0.05,P<0.01),并下調(diào)Wnt通路重要負(fù)調(diào)控因子GSK3β的表達(dá)(P<0.05,P<0.01),但對Wnt10b的表達(dá)無顯著性影響。

    圖6 Hm-FUC對β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of β-catenin and its target genes cmyc and CCND1 in 3T3-L1 preadipocytes

    此外,由圖6可知,Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可顯著上調(diào)β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1的mRNA表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。上述結(jié)果提示,不同高級結(jié)構(gòu)的Hm-FUC均能顯著上調(diào)Wnt/β-catenin通路,其中Hm3(210 kDa,無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象)效果最優(yōu)。

    3 討 論

    本實驗在體外水平對不同高級結(jié)構(gòu)Hm-FUC調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的活性及其機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,4 種Hm-FUC均可顯著抑制脂肪細(xì)胞分化,其中Hm3(210 kDa,無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象)活性最強(qiáng)。

    脂肪細(xì)胞分化過程受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,主要包括PPARγ、SREBP1c和C/EBPα。Hwang等[24]證實秋葵葉提取物通過下調(diào)PPARγ和C/EBPα等關(guān)鍵脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來抑制脂肪形成。Jeong等[25]發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)SREBP-1c蛋白磷酸化,抑制其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位并與靶基因結(jié)合,從而減少脂肪生成基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。本實驗中,Hm-FUC能顯著下調(diào)SREBP-1c、PPARγ、C/EBPα的mRNA表達(dá),表明Hm-FUC通過抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),下調(diào)下游脂肪特異性基因的表達(dá),從而抑制脂肪細(xì)胞分化。

    Wnt配體(如Wnt6、Wnt10a和Wnt10b)可與細(xì)胞膜上Frz受體及LRPs輔助受體結(jié)合激活Wnt/β-catenin通路[26]。當(dāng)Wnt信號被激活時,β-catenin得以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定積累,進(jìn)而移至核內(nèi),與TCF/LEF相互作用,調(diào)節(jié)下游靶基因CCND1和cmyc的表達(dá)。CCND1和cmyc通過合成組蛋白去乙?;负鸵种艭/EBPα活性進(jìn)而抑制PPARγ功能,最終抑制脂肪生成[27-28]。本研究中,4 種Hm-FUC均可在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)Wnt通路關(guān)鍵基因表達(dá),但對Wnt10b的mRNA表達(dá)無顯著影響。Wnt10b為一類分泌蛋白,而本研究尚未對Wnt10b的蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。此外,Lee等[29]研究發(fā)現(xiàn),IL-6可以激活Wnt/β-catenin通路而Wnt10b表達(dá)無顯著變化。Hm-FUC通過激活Wnt/β-catenin通路,抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα表達(dá),從而抑制脂肪分化。

    分子質(zhì)量變化對多糖生物活性有著重要影響。Bhadja等[30]證實了低分子質(zhì)量降解海藻多糖對受損HK-2細(xì)胞的修復(fù)活性優(yōu)于未降解多糖;王鳳舞等[31]在衰老模型小鼠上進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酶解的巖藻低聚糖相比于巖藻聚糖硫酸酯表現(xiàn)出更優(yōu)越的抗氧化活性,清除羥自由基效果更好。本研究結(jié)果表明,酶解后的低分子質(zhì)量Hm-FUC對脂肪生成的抑制效果優(yōu)于原糖,且隨著Mw降低,效果增強(qiáng);但當(dāng)分子質(zhì)量降到一定程度,抑制脂肪生成效果反而減弱,表明Hm-FUC的分子質(zhì)量與其抑制脂肪生成活性之間為非線性關(guān)系。Xu Zhou等[32]從油茶籽餅多糖中分離出分子質(zhì)量為7.9、36、83 kDa和225 kDa的低分子質(zhì)量多糖,其中分子質(zhì)量為36 kDa時清除自由基能力最強(qiáng),優(yōu)于其他分子質(zhì)量多糖。這與本研究結(jié)果是一致的,分子質(zhì)量過大或過小都不利于多糖生物活性的發(fā)揮。

    鏈構(gòu)象是不同分子質(zhì)量多糖表現(xiàn)出活性差異的一個重要因素,且目前相關(guān)研究主要集中在鏈形態(tài)和主鏈柔順性上。巖藻聚糖硫酸酯內(nèi)切酶CZ1127 Fucoidanase可以特異性切割α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→3)-α-L-Fucp之間的α(1→3)-糖苷鍵[33],在分子質(zhì)量降低過程中,Hm-FUC分子鏈不斷變短,同時分子的負(fù)電性降低,當(dāng)分子質(zhì)量降到一定程度時,轉(zhuǎn)化為球形構(gòu)象。朱玉婕[34]研究了3 種SC-FUC分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象與改善胰島素活性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)與球形構(gòu)象相比,當(dāng)SC-FUC為無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象時改善胰島素抵抗的效果更好。Xu Xiaoqi等[35]的研究證明了梅花參巖藻聚糖硫酸酯球形構(gòu)象對胃黏膜的保護(hù)作用優(yōu)于無規(guī)卷曲構(gòu)象。在本研究中,當(dāng)Hm-FUC多糖由無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)化為球形鏈構(gòu)象時,抑制脂肪細(xì)胞分化活性減弱。通過酶切的作用,Hm-FUC的αs參數(shù)隨Mw的降低而下降,說明Hm-FUC原糖的半剛性鏈被打散,多糖鏈構(gòu)象趨于松散、柔順。本研究中,在無規(guī)卷曲鏈構(gòu)象范圍內(nèi),隨著主鏈柔順性增加,Hm-FUC的抑制脂肪生成活性增強(qiáng)。上述研究表明,Hm-FUC分子質(zhì)量變化引起的鏈構(gòu)象變化是其活性改變的重要原因,可能是脂肪細(xì)胞對不同鏈形態(tài)的敏感度不同,因此鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致了其活性的變化;而當(dāng)多糖鏈形態(tài)相同時,主鏈的柔順性在一定程度上影響其生理活性,但多糖鏈構(gòu)象差異影響其活性的內(nèi)在原因還需要通過進(jìn)一步實驗深入探究。

    綜上所述,Hm-FUC可以抑制脂肪細(xì)胞分化,該作用是通過Wnt/β-catenin通路實現(xiàn)的。在100~4 000 kDa分子質(zhì)量范圍內(nèi),210 kDa、無規(guī)卷曲短鏈構(gòu)象的Hm-FUC抑脂活性最強(qiáng)。本實驗研究了Hm-FUC高級結(jié)構(gòu)與其抑制脂肪細(xì)胞分化活性之間的關(guān)系,為Hm-FUC的高效利用和深度開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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