基于iTRAQ定 量蛋白質(zhì)組學(xué)的三文魚新鮮度分析

馬聰聰，張九凱，韓建勛，邢冉冉，郝建雄，陳 穎

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

三文魚屬于大中型冷水域洄游魚類，主要分布在太平洋北部及大西洋和北冰洋交界水域。因其肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩和高營養(yǎng)價(jià)值[1]，近年來逐漸被作為生食料理店的上等原料。因最早出口中國的三文魚主要來自歐洲，所以嚴(yán)格意義上來講，傳統(tǒng)的三文魚指的就是大西洋鮭（Salmo Salar）。在我國，三文魚主要食用方式為生食，因此對其新鮮度的要求非常高[2]。目前常用的新鮮度檢測方法有傳統(tǒng)感官評價(jià)[3]以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的現(xiàn)代化感官仿生識別技術(shù)[4-5]、微生物評價(jià)[6]和傳統(tǒng)理化分析[7-8]，隨著光譜技術(shù)的發(fā)展，具有快速、無損、成本低以及適合在線檢測等特點(diǎn)的紅外光譜、熒光光譜、核磁共振、拉曼光譜等新興無損檢測技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注[9-11]，但這些技術(shù)手段通常是從新鮮度變化的終端入手來表征魚類所處的新鮮度狀態(tài)。為進(jìn)一步探究魚類新鮮度變化的機(jī)理，基于質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)的新鮮度研究技術(shù)逐漸發(fā)展起來。二維電泳耦合質(zhì)譜技術(shù)（two-dimensional electrophoresis coupled mass spectrometry，2DE-MS）即是其中之一。利用二維電泳可以直觀地對比出不同品質(zhì)魚類中的差異蛋白點(diǎn)，然后通過質(zhì)譜技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，找到變化蛋白，進(jìn)而分析出貯存過程中新鮮度變化的機(jī)理[12-13]，但是二維電泳也存在一定局限性，比如，對于一些酸性蛋白或堿性蛋白不能實(shí)現(xiàn)很好的分離。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)是一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高分辨率質(zhì)譜儀分析，可同時(shí)比較多達(dá)8 個(gè)樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)[14-16]。如Huan Chen等[17]采用iTRAQ技術(shù)對不同溫度貯存的桃果實(shí)成熟衰老過程中的蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果共找到325 種差異表達(dá)蛋白，它們主要參與碳水化合物和能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)和防御等生物學(xué)過程。Shi Jing等[18]同樣采用該技術(shù)對新鮮泥蝦和凍融后泥蝦肌肉中的蛋白進(jìn)行了對比分析，共找到226 種差異蛋白，并在進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析中探明其品質(zhì)變化的機(jī)理。三文魚肉質(zhì)細(xì)膩，在人們?nèi)粘ｏ嬍持姓紦?jù)越來越大的比重[19-20]，越來越多的方法應(yīng)用于三文魚新鮮度的檢測和判定，但對其貯存過程中新鮮度變化機(jī)理研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對0 ℃條件下不同貯存時(shí)間三文魚蛋白進(jìn)行對比分析，為揭示三文魚新鮮度變化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮三文魚（物種：大西洋鮭；質(zhì)量：（6.5±0.2）kg；原產(chǎn)國：挪威），于挪威當(dāng)?shù)夭稉坪罅⒓丛讱?，去除?nèi)臟，冰鮮空運(yùn)至北京海關(guān)，然后于3 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

尿素 美國Promega公司；硫脲 美國Americo公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 美國Bio-Rad公司；乙腈（色譜純）、胰蛋白酶 美國Thermo Fisher-Pierce公司；10 kDa離心濃縮裝置 美國Sigma公司；Qubit?3.0熒光定量試劑盒 美國Life Invitrogen公司；iTRAQ?Reagent-8Plex試劑盒 美國AB SCIEX公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera X2液相色譜（liquid chromatography，LC）儀日本Shimadzu公司；Triple-TOF 6600高分辨質(zhì)譜儀美國AB SCIEX公司；Xbridge Peptide BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 ?） 美國Waters公司；Durashell-C18高pH反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?） 天津Agela公司；pH計(jì)、ME403E型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Qubit?3.0熒光定量儀 美國Life Invitrogen公司；Centrifuge 5418R型離心機(jī)、Concentrator plus型真空濃縮儀 德國Eppendorf公司；TissueLyser II組織研磨儀 德國Qiagen公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國Scientific Industries公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，將其去皮、去刺、切成均勻小塊（平均長（5.0±0.5）cm、寬（5.0±0.5）cm），隨機(jī)分為4 份裝入密封袋中，置于冰上（0±1）℃保存，分別于第0、5、10、15天取樣，用于iTRAQ蛋白定量分析（圖1）。新鮮對照組（0 d）和不同貯存時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組（5、10、15 d）分別做兩組平行，依次標(biāo)記為0 d-1、0 d-2、5 d-1、5 d-2、10 d-1、10 d-2、15 d-1和15 d-2。

圖1 iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析冰鮮三文魚新鮮度流程圖Fig. 1 Flow chart of iTRAQ proteomic analysis for the freshness of chilled salmon

1.3.2 蛋白質(zhì)提取與定量

樣品取出后經(jīng)組織研磨儀研磨后進(jìn)行勻漿，準(zhǔn)確稱取混合均勻的魚糜1 g，加入15 倍體積的尿素裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲），漩渦混勻后冰浴振蕩提取1 h，結(jié)束后于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，收集上清液。利用Qubit?熒光定量試劑盒測定蛋白濃度，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對蛋白質(zhì)的提取質(zhì)量和濃度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 蛋白質(zhì)酶解

蛋白定量后，參照Wang Chong等[21]的蛋白處理?xiàng)l件，結(jié)合iTRAQ?Reagent-8Plex試劑盒說明書進(jìn)行蛋白酶解。即分別取含有80 μg蛋白的提取液置于離心管中，分別加入4 μL iTRAQ試劑盒中Reducing Reagent溶液，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，加入2 μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫避光放置10 min，將還原烷基化后的蛋白溶液轉(zhuǎn)移至10 kDa的超濾管中，12 000×g離心20 min，棄掉收集管底部溶液。然后按照酶與底物1∶40的體積比向超濾膜中分別加入2 μg胰蛋白酶，37 ℃條件反應(yīng)6 h，12 000×g離心20 min，得到酶解后的肽段。

1.3.4 iTRAQ標(biāo)記

從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，向8 管iTRAQ試劑（圖1中編號113～121）中分別加入200 μL異丙醇稀釋，然后與對應(yīng)的肽段樣品混合（113和114分別標(biāo)記0 d-1和0 d-2；115和116標(biāo)記5 d-1和5 d-2；117和118標(biāo)記10 d-1和10 d-2；119和121標(biāo)記15 d-1和15 d-2），室溫反應(yīng)2 h，然后加入100 μL去離子水終止反應(yīng)。混合標(biāo)記后的樣品，漩渦振蕩混勻，取出20 μL混合標(biāo)記肽段，用Ziptip脫鹽后進(jìn)行Triple-TOF 6600質(zhì)譜鑒定，以檢測標(biāo)記效率和質(zhì)量，其余混合液旋轉(zhuǎn)真空干燥后冷凍保存待用。

1.3.5 高pH反相色譜分級

將干燥后的標(biāo)記肽段溶解在1 0 0 μ L 流動(dòng)相A（20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0）中，用Durashell-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 ?）進(jìn)行洗脫。參考華愉教等[22]的第一維高pH反相液相色譜分離條件，對洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，具體為流速0.8 mL/min，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)80%乙腈溶液（含20 mmol/L甲酸銨，pH 10.0），梯度洗脫程序如下：0～5 min，5% B；5～30 min，5%～15% B；30～45 min，15%～38% B；46 min上升至90% B，并持續(xù)至55 min；55～65 min，5% B。總洗脫時(shí)間65 min，將前60 min的洗脫液接入60 個(gè)1.5 mL離心管中，按極性合并成16 管肽段復(fù)合物，真空干燥備用。

1.3.6 高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析

參照Wang Zhixiu等[15]的LC-MS條件，對洗脫梯度和質(zhì)譜去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，然后對樣品肽段進(jìn)行LC-MS分析。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件：色譜柱為Xbridge Peptide BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，300 ?），流動(dòng)相A為2%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的乙腈溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為98%的乙腈溶液（含0.1%甲酸）。將16 管分級后的肽段分別用流動(dòng)相A復(fù)溶后進(jìn)行后續(xù)分析。設(shè)定流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序：0～1 min，2%～5% B；1～30 min，5%～20% B；30～54 min，20%～42% B；54.5～62 min，80% B；62.1～68 min，2% B。

M S 條件：采用正離子掃描模式，掃描范圍350～1 500 m/z。霧化器：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：550 ℃；去簇電壓：80 V；離子碰撞能量：10 V。

1.3.7 蛋白質(zhì)鑒定

使用ProteinPilot 5.0.2軟件對分級后的16 管肽段質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行合并和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，利用Excel軟件對蛋白可信肽段數(shù)和覆蓋率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和展示說明。三文魚物種原始蛋白庫于Uniprot（http://www.uniprot.org）上進(jìn)行下載，共含有88 995 條目標(biāo)肽段序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

差異表達(dá)蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，即對兩次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05的蛋白認(rèn)為差異顯著；差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于1.2或小于0.83，即倍數(shù)變化大于1.2（上調(diào)）或小于0.83（下調(diào)）認(rèn)為是差異蛋白[21]，利用Origin 9.0軟件對目標(biāo)蛋白進(jìn)行火山圖繪制，并用顏色進(jìn)行標(biāo)注（紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)），進(jìn)行后續(xù)分析。

利用歐洲生物信息研究所維護(hù)的QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）注釋工具對差異蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋[23]，然后利用在線分析工具Omicshare（https://www.omicshare.com/tools）對每個(gè)GO條目下富集的差異蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，隨后采取超幾何檢驗(yàn)方法確定出差異蛋白中顯著富集的GO條目。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行代謝通路分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三文魚肌肉蛋白基本信息

質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過ProteinPilot 5.0.2軟件的搜索和篩選后共獲得10 828 個(gè)二級譜圖，匹配到3 355 個(gè)肽段，對應(yīng)257 個(gè)蛋白質(zhì)，其中可信蛋白150 個(gè)。對iTRAQ數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步整理分析發(fā)現(xiàn)這150 個(gè)蛋白中，有8 個(gè)只含有1 條可信肽段，其余142 個(gè)蛋白至少含有兩條可信肽段（圖2A）。此外，如圖2B所示，有42%的蛋白質(zhì)序列覆蓋率即質(zhì)譜檢測出的肽段氨基酸序列占整個(gè)蛋白序列的比率超過50%，結(jié)果表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析是可靠的。

圖2 三文魚蛋白包含的可信肽段數(shù)量（A）和蛋白序列覆蓋度（B）Fig. 2 Statistics of the number of trusted peptide segments of proteins (A)and protein sequence coverage (B) in salmon

2.2 差異蛋白篩選與分析結(jié)果

圖3 0 ℃條件下三文魚貯藏不同時(shí)間后的差異蛋白火山圖和韋恩圖Fig. 3 Volcanic maps and Venn map of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

差異蛋白的篩選條件為“FC大于1.2或小于0.83，P＜0.05”。由差異蛋白火山圖（圖3A～C）可以直觀地看出上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分布情況。與貯藏0 d冰鮮三文魚樣品相比，在3 個(gè)不同貯存時(shí)間的處理組中共找到62 個(gè)差異蛋白，其中有29 個(gè)蛋白在貯存5 d后發(fā)生了顯著變化，22 個(gè)貯存10 d后發(fā)生了變化，52 個(gè)在貯存15 d后發(fā)生了變化，結(jié)果表明隨著貯存時(shí)間的延長，蛋白變化速率加快。另外，利用韋恩圖（圖3D）對這些蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有12 個(gè)差異蛋白在3 個(gè)處理組中均被篩選出來；有6 個(gè)蛋白在貯存前5 d沒有明顯變化，但貯存10 d后開始出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，隨著生化過程的進(jìn)行，有24 個(gè)蛋白直到貯存15 d后才發(fā)生明顯變化，可能是由于貯存過程中，一些代謝產(chǎn)物積累而誘發(fā)了新的生物反應(yīng)過程；10 個(gè)蛋白隨著貯存時(shí)間的延長出現(xiàn)了先增多后減少或先減少后增多的變化趨勢，進(jìn)一步證明了蛋白變化與貯存時(shí)間具有密切聯(lián)系。這些蛋白可能是與冰鮮三文魚品質(zhì)密切相關(guān)的潛在蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。

2.3 差異蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖4 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白GO功能注釋圖Fig. 4 Gene ontology annotation of di-erentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

通過GO注釋分析可以對差異蛋白行使的主要生物學(xué)功能進(jìn)行分類，對3 個(gè)比較組的差異蛋白進(jìn)行GO注釋發(fā)現(xiàn)，3 組差異蛋白主要參與的生物學(xué)進(jìn)程均包括代謝過程、細(xì)胞過程和單有機(jī)體過程（圖4）；在細(xì)胞組分分類中，主要參與細(xì)胞、單元部分、高分子絡(luò)合物以及細(xì)胞器組成。在分子功能方面，5 d/0 d比較組中的29 個(gè)差異蛋白主要具有催化活性，然后依次為離子結(jié)合和ATP/ADP結(jié)合；10 d/0 d比較組中的22 個(gè)差異蛋白前三大功能依次為催化活性、ATP/ADP結(jié)合和核苷酸結(jié)合；15 d/0 d比較組的52 個(gè)差異蛋白中，主要參與離子結(jié)合，ATP/ADP結(jié)合、催化活性和核苷酸結(jié)合也占較大比例。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析了不同蛋白質(zhì)的代謝途徑（表1）。發(fā)現(xiàn)62 個(gè)差異蛋白共參與了56 個(gè)代謝途徑。其中5 d/0 d和15 d/0 d比較組中的差異蛋白主要富集在代謝通路、糖酵解/糖異生通路、碳代謝通路和氨基酸生物合成通路；10 d/0 d比較組中的差異蛋白重點(diǎn)參與代謝通路、糖酵解/糖異生通路、碳代謝通路和緊密連接通路。

表1 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白顯著富集的KEGG通路Table 1 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway with significant enrichment of differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

2.4 差異蛋白與新鮮度相關(guān)性分析結(jié)果

表2 0 ℃條件下貯存5、10 d和15 d后三文魚差異蛋白信息Table 2 Information about differentially expressed proteins in salmon after 5, 10 and 15 days storage at 0 ℃

續(xù)表2

對3 個(gè)比較組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了綜合分析，共篩選出28 個(gè)與三文魚貯存期間品質(zhì)變化相關(guān)的蛋白（表2），其中2 個(gè)蛋白在儲存初期上調(diào)，但隨著儲存時(shí)間的延長開始降解；10 個(gè)蛋白在儲存5 d時(shí)就發(fā)生了顯著下調(diào)，隨著儲存時(shí)間的延長繼續(xù)發(fā)生不同程度的降解；3 個(gè)蛋白在儲存5 d時(shí)沒有發(fā)生明顯變化，但儲存10 d后開始減少；13 個(gè)蛋白在儲存10 d以內(nèi)含量不變，但儲存15 d后發(fā)生明顯降解。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們分別與糖代謝、肌肉收縮、骨架蛋白、能量代謝及脂肪代謝和肽鏈延伸等功能相關(guān)。

2.4.1 糖代謝相關(guān)蛋白分析結(jié)果

與糖代謝相關(guān)的蛋白有7 個(gè)，分別為果糖二磷酸醛縮酶（A0A1S2WZE0）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（A0A1S3PV75）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（B5DGR3）、磷酸甘油酸激酶（B5DFX8）、磷酸甘油酸變位酶（B5DGT9）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（B5DGL3）和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶（B5DG55）。以上差異蛋白均為糖酵解和糖異生途徑中重要的催化酶，在貯存第5天開始下調(diào)，這主要是由于魚體死后，血液循環(huán)停止，機(jī)體不再供氧，但有氧酵解被無氧酵解替代，使肌肉組織中糖代謝過程仍然能維持一段時(shí)間，因此短時(shí)間內(nèi)肌肉具有一定的生理活性，相關(guān)的催化酶被不斷消耗，貯存初期出現(xiàn)緩慢下調(diào)。但隨著貯存時(shí)間的延長，糖原不斷減少，乳酸積累，魚體pH值逐漸下降，糖代謝相關(guān)的催化酶被鈍化，反應(yīng)過程停止，進(jìn)一步導(dǎo)致相關(guān)的催化酶被分解，含量出現(xiàn)顯著下調(diào)。

2.4.2 肌肉收縮相關(guān)蛋白分析結(jié)果

與肌肉收縮相關(guān)的蛋白有9 個(gè)，分別為肌球蛋白重鏈（A0A1S3M1A4）和肌球蛋白-6（A0A1S3R4R2）、肌球蛋白輕鏈（B5DH12）及其亞型（B5DGT2、B5DGT1）、肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈（Q7ZZN0）、肌鈣蛋白-T（B5DH00）和LDB3蛋白（A0A1S3N253、B5DGH1）。肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位，由兩條肌球蛋白重鏈、兩條肌球蛋白輕鏈和兩條調(diào)節(jié)性輕鏈構(gòu)成，在肌肉收縮中起重要作用[24]。魚體死后初期進(jìn)入僵直階段，肌原纖維產(chǎn)生收縮張力，肌節(jié)中的Z線在持續(xù)的張力作用下斷裂，肌原纖維小片化程度增大；因此隨著貯藏時(shí)間的延長，肌球蛋白等會不斷降解。在本研究中發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白重鏈和肌球蛋白-6在貯存第5天就發(fā)生了明顯降解，肌球蛋白輕鏈及其亞型、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈在貯存后期也發(fā)生顯著下調(diào)，這與Shi Jing等[18]的研究結(jié)果一致，符合魚體死后蛋白變化規(guī)律。另外，LDB3蛋白是肌原纖維結(jié)構(gòu)中的一個(gè)連接蛋白，通過其LIM域?qū)⒌鞍准っ窩介導(dǎo)的信號耦合到細(xì)胞骨架上。三文魚在0 ℃貯藏過程中，該蛋白質(zhì)含量迅速下降，主要因?yàn)轸~體死后，細(xì)胞滲透壓升高，導(dǎo)致肌原纖維結(jié)構(gòu)脆弱，使其更易受到水解酶的作用而降解，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)蛋白減少。該結(jié)果與李婷婷[25]對大黃魚新鮮度研究的結(jié)果一致。

2.4.3 骨架蛋白分析結(jié)果

在三文魚貯存期間發(fā)生明顯變化的骨架蛋白有3 個(gè)，分別為角蛋白（A0A1S3LJL5）、肌原調(diào)節(jié)蛋白（B5DFZ6）和肌聯(lián)蛋白亞型（A0A1S3PNJ9）。角蛋白是中間絲蛋白家族（也稱中間纖維）最大的亞群，主要表達(dá)于上皮組織中，具有維持細(xì)胞形狀的功能。魚體貯存過程中的自溶作用導(dǎo)致結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白降解，為了維持細(xì)胞器的穩(wěn)定性，角蛋白含量在貯存前期有增多趨勢；但貯存后期開始下調(diào)，是貯存后期降解作用逐漸增大造成的。肌原調(diào)節(jié)蛋白是一種骨骼肌Z線蛋白，主要在骨骼肌中表達(dá)，而在其他一些組織中的表達(dá)水平較低[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在冷藏過程中，肌原調(diào)節(jié)蛋白和肌聯(lián)蛋白均發(fā)生明顯降解，主要與魚肉死后僵直有關(guān)，導(dǎo)致肌原纖維的連接和穩(wěn)定性下降，僵直解除后，魚肉硬度下降、嫩度提高，使組織蛋白酶更容易作用于結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉彈性變差，品質(zhì)開始劣變，Wang Chong等[21]利用iTRAQ定量技術(shù)對冰點(diǎn)貯存的縊蟶（Razor clam）進(jìn)行差異蛋白分析，同樣發(fā)現(xiàn)肌聯(lián)蛋白與貯存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

2.4.4 能量代謝相關(guān)蛋白

魚體死后糖酵解的速率是由ATP酶活性控制的，ATP酶活力大小直接影響新陳代謝的能力，進(jìn)而影響魚肉品質(zhì)[27]。參與三文魚貯存過程中能量代謝的差異蛋白有6 個(gè)，其中ATP合酶（A0A1S3NPS0、B5RI36）、ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶（B5DGZ1）、線粒體型肌酸激酶（B5DFT9）、腺苷酸激酶同工酶（B5DGM6）顯著下調(diào)，AMP脫氨酶（B5DFU7）在貯存初期出現(xiàn)微量上調(diào)，然后隨著貯存時(shí)間的延長含量趨于不變。魚體死后，肌肉組織中開始進(jìn)行無氧酵解，每分子葡萄糖氧化產(chǎn)生的ATP數(shù)由原來的39分子減少到3分子，ATP含量急劇下降，因此導(dǎo)致ATP合酶和ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶含量減少。線粒體型肌酸激酶與肌肉收縮、能量合成和能量傳遞直接相關(guān)，能可逆地催化肌酸和ATP之間的轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)。該蛋白在貯藏過程中豐度降低，這可能與魚體死后肌酸的降解有關(guān)。腺苷酸激酶同工酶在細(xì)胞能量平衡和腺嘌呤核苷酸代謝中起著重要作用。定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白在貯存后期出現(xiàn)明顯降解，也主要與葡萄糖無氧降解導(dǎo)致ATP產(chǎn)生量急劇減少有關(guān)，與冰點(diǎn)貯存的縊蟶（Razor clam）肌肉蛋白中腺苷酸激酶變化趨勢[21]一致。魚體死后，ATP會分解成多種代謝物，包括二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、一磷酸肌苷（inosine monophosphate，IMP）、次黃嘌呤核苷（inosinecreatinine，H x R）和次黃嘌呤（h y p o x a n t h i n e，H x），主要步驟為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，其中AMP→IMP為限速步驟，IMP經(jīng)歷積累和快速降解過程[28]，AMP脫氨酶主要催化AMP脫氨生成IMP，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMP脫氨酶在貯存5 d時(shí)含量升高，10 d后下降，可能與IMP變化規(guī)律有關(guān)。

2.4.5 脂肪代謝相關(guān)蛋白

載脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I precursor，apoA-I）是高密度脂蛋白中最重要的載脂蛋白。在脂質(zhì)的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)以及脂肪代謝調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，作為脂肪傳感器來調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的轉(zhuǎn)錄[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)apoA-I在貯存10 d內(nèi)沒有發(fā)生明顯降解，但在15 d后含量減少，應(yīng)該是受脂肪酸代謝影響。

2.4.6 肽鏈延長與分解相關(guān)蛋白

泛素是一種存在于所有真核生物（大部分真核細(xì)胞）中的小蛋白，它的主要功能是標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被26S蛋白酶體降解。在貯存前10 d，該蛋白含量沒有明顯變化，主要是由于三文魚貯藏過程中生化過程減弱，各蛋白分解作用加強(qiáng)，泛素一直保持活躍狀態(tài)；貯存15 d后含量明顯下降，主要是后期酶和微生物作用導(dǎo)致的。真核細(xì)胞延伸因子是一類在蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮肽鏈延伸作用的重要分子，只在骨骼肌、心臟和神經(jīng)元中表達(dá)[31]，GO注釋表明其主要的分子功能是促進(jìn)核苷酸結(jié)合，與蛋白合成密切相關(guān)。該蛋白在貯存初期就發(fā)生明顯降解，貯存15 d后幾乎消失，主要是由于魚體死后蛋白分解過程加速，合成停止，真核細(xì)胞延伸因子生物作用消失，逐漸被內(nèi)源性酶和微生物分解。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ技術(shù)對0 ℃條件下貯存不同時(shí)間的三文魚新鮮度進(jìn)行了研究，篩選出28 個(gè)可能與三文魚貯存期間品質(zhì)變化相關(guān)的差異蛋白，并將其分為6 類進(jìn)行了詳細(xì)的代謝通路分析。這些蛋白均隨著貯存時(shí)間的延長發(fā)生不同程度的下調(diào)和上調(diào)，并與魚體死后僵直和解僵、葡萄糖無氧酵解、細(xì)胞器穩(wěn)定、肌肉收縮和蛋白合成與分解密切相關(guān)，因此可以作為研究三文魚新鮮度變化的潛在差異蛋白。為深入了解0 ℃條件下不同貯存時(shí)間的三文魚品質(zhì)變化機(jī)理提供了一定的參考，下一步可針對代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分析，以發(fā)現(xiàn)三文魚品質(zhì)劣變過程中相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律。