miR-200b靶向調(diào)控性別決定相關(guān)基因簇2對(duì)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

余麗金,許 艷, 凌 奕

0 引 言

胎盤(pán)是維系母體與胎兒之間物質(zhì)運(yùn)輸與氣體交換的重要器官，受到細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子等多種因素的調(diào)控[1]。子癇前期屬于胎盤(pán)源性疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒發(fā)病或死亡的重要病因，但子癇前期的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞在胎盤(pán)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用[2]。此外，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲功能異常能引起子癇前期的發(fā)生。因此近年來(lái)關(guān)于滋養(yǎng)層細(xì)胞在妊娠過(guò)程中的作用備受關(guān)注。微小RNA(micro RNA，miR)是生物內(nèi)序列高度保守的非編碼RNA分子。近年研究表明，miRNA及其相關(guān)信號(hào)通路在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。最新研究表明，miR-200b在子癇前期胚胎絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)異常[4]。另有報(bào)道稱miR-200b能影響胚胎應(yīng)激狀態(tài)下的絨毛外血管網(wǎng)的構(gòu)建[5]。性別決定相關(guān)基因簇2(sex determining region Y，SOX2)是SOX家族中的重要成員之一[6]。研究顯示，SOX2與多種腫瘤的增殖和遷移密切相關(guān)，如在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等中高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用[7]。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在細(xì)胞滋養(yǎng)層、絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中均有表達(dá)，隨著妊娠的進(jìn)行，在晚期妊娠胎盤(pán)中表達(dá)逐漸下降[8]。據(jù)報(bào)道，在膠質(zhì)瘤中SOX2表達(dá)受miR-200b的調(diào)控作用[9]，但目前這種調(diào)控關(guān)系是否通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移來(lái)影響子癇前期的機(jī)制報(bào)道較少。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行研究，探討miR-200b、SOX2對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲作用的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年12月至2019年1月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科留取的40份胎盤(pán)組織標(biāo)本。其中子癇前期患者18例，正常妊娠者22例。子癇前期患者年齡22～35歲，平均年齡(28.32±4.23)歲；正常妊娠者年齡21～33歲，平均年齡(27.43±4.23)歲。正常妊娠者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①既往體??；②孕37周后分挽；③孕期順利，血壓正常、尿蛋白為陰性；④無(wú)妊娠合并癥及并發(fā)癥的發(fā)生。子癇前期患者納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠周后發(fā)生的高血壓，并合并蛋白尿者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有慢性高血壓、糖尿病、慢性腎病以及心臟病等病史。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：A2017-008-02)，研究對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。

1.2材料及主要儀器慢病毒包裝的miRNA-200b、SOX2過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒pHRi-miRNA-200b、pHRi-SOX2和短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)、慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pHRi-sh-SOX2、miRNA-200b模擬物(miRNA-200b minic)及其陰性對(duì)照(minic-NC)均購(gòu)自上海吉瑪有限公司，人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8-SVneo購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，DAB試劑盒(美國(guó)Amresco公司)， Western blot試劑盒(Santa Cruz公司)， DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，熒光素酶基因報(bào)告分析試劑盒(美國(guó)Abcam公司)、Lipofectamine-3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)、全蛋白抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，SYBR Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒(QPK-201，日本TOYOBO公司)；Transwell小室(美國(guó)BD公司)，MTT試劑盒(美國(guó)CST公司)，microRNA Isolation Kit試劑盒(美國(guó)Sigma公司)。

Nikon Ti-U/Ti-s倒置顯微鏡(Thermofisher公司)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國(guó)Beckma公司)，生物顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Fermentas公司)，Roche R480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Heal Force公司)，SANYO MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)BD公司)，蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)(SANYO公司)，5810R 型高速離心機(jī)(日本島津公司)。

1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)胎盤(pán)組織標(biāo)本中SOX2的表達(dá)將收集的正常胎盤(pán)組織及子癇前期胎盤(pán)組織樣本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后，檸檬酸鹽緩沖液中修復(fù)，3%的雙氧水室溫下浸泡10 min，封閉，加入稀釋好的一抗維持4 ℃過(guò)夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入二抗，室溫孵育30 min，清洗。加適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作用2～5 min后用去離子水終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：由兩位副主任病理醫(yī)師對(duì)病理切片進(jìn)行盲評(píng)，綜合評(píng)分。每張切片中隨機(jī)選取5個(gè)清晰高倍視野，包含標(biāo)本中的絕大部分組織，以每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞為單位，以細(xì)胞出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒判為陽(yáng)性表達(dá)，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度計(jì)分依據(jù)：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，< 25%為1分，25%～50% 為2 分，51%～75% 為3分，> 75% 為4分。以上2項(xiàng)計(jì)分相加結(jié)果≥3判為陽(yáng)性。

1.4高通量測(cè)序篩選差異miRNA并繪制聚類圖在正常妊娠者與子癇前期患者組織標(biāo)本中分別隨機(jī)抽取3例進(jìn)行高通量測(cè)序，使用microRNA Isolation Kit試劑盒提取并純化標(biāo)本中小RNA備用，操作嚴(yán)格遵照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。構(gòu)建正常胎盤(pán)組織和子癇前期胎盤(pán)組織的miRN文庫(kù)，采用llumina HiSeq2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序，F(xiàn)satQC檢測(cè)篩選高質(zhì)量整潔序列。保留2個(gè)樣本中Reads之和≥10、|log2FC |>1及P<0.05的基因；再采用MEV( V4.6，Tiger) 對(duì)篩選出的miRNA 進(jìn)行聚類分析。根據(jù)P值篩選出在不同組織中表達(dá)差異最大的40個(gè)miRNA。

1.5RT-qPCR檢測(cè)分析miRNA的表達(dá)采用Trizol法提取不同組織標(biāo)本的總RNA，常規(guī)方法檢測(cè)RNA的濃度和純度，取出25%的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行，使用引物如下：microRNA-200b(FP:5′-GGCTGAGGGTTAGTGAGC AG-3′，RP: 5′-AAAGGGAGTTGGTGAAAGACA-3′)，U6作為內(nèi)參(FP: 5′-TCGACGAATTG CAGTACU-3′，RP:5’-GCAACGCAUCTTTCTATUC-3′)，反應(yīng)條件：75°C預(yù)變性，2min，進(jìn)入以下循環(huán)90℃變性，5min；60°C退火，60s； 72°C延伸，30s；共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.6生物信息學(xué)預(yù)測(cè)使用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase預(yù)測(cè)SOX2可互補(bǔ)結(jié)合的miRNA，并在http://genemania.org上查詢了SOX2與基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP9)的相互作用關(guān)系。

1.7熒光素酶基因報(bào)告分析采用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan預(yù)測(cè)miR-200b和SOX2的結(jié)合片段。采用PCR擴(kuò)增含有miR-200b結(jié)合位點(diǎn)的SOX2片段，并將該擴(kuò)增片段插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒并記為psi-CHECK-SOX2-wild，同時(shí)采用基因突變技術(shù)對(duì)結(jié)合片段中的核苷酸進(jìn)行突變，并構(gòu)建突變型質(zhì)粒psi-CHECK-SOX2-mutant。將miR-200b minic及陰性對(duì)照minic-NC分別與空載質(zhì)粒、野生型質(zhì)粒psi-CHECK-SOX2-wild和突變型質(zhì)粒psi-CHECK-SOX2-mutant共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h，根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定熒光素酶活性，螢火蟲(chóng)熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

1.8細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組將HTR8-SVneo細(xì)胞接種于含有滅活的10%FBS、peillin G、STC的DMEM培養(yǎng)基中，生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2)，當(dāng)有85%細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 3000通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染慢病毒，轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書(shū)操作。分組方法：空載組(轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)?？蛰d)、miRNA-200b組(轉(zhuǎn)染pHRi-miRNA-200b)、sh-SOX2組(轉(zhuǎn)染pHRi-sh-SOX2)、miRNA-200b+SOX2組(共轉(zhuǎn)染pHRi-miRNA-200b、pHRi-SOX2質(zhì)粒)。

1.9Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前12 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，將40 μL matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室中，消化細(xì)胞并用1 μL PBS清洗2遍，將500 μL 完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105細(xì)胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μL 細(xì)胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無(wú)氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng) 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μL進(jìn)行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過(guò)膜的細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。

1.10劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h后調(diào)整細(xì)胞密度，以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到 90% 以上時(shí)，采用200 μL槍頭在板中間劃線，PBS清洗3次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在普通顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞在0和24 h遷移情況的照片，對(duì)照片進(jìn)行分析并計(jì)算遷移率。

1.11Western blot檢測(cè)SOX2、MMP2與MMP9蛋白的表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，采用常規(guī)方法提取目標(biāo)蛋白SOX2、MMP2與MMP9，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，準(zhǔn)確量取50 μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后，將樣品蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)膜上，加入10%脫脂奶粉封閉3 h，以(1∶1500)比例稀釋后，維持4 ℃過(guò)夜孵育，洗滌加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育3 h， 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ELC顯色30 min，經(jīng)曝光、顯影、定影后，以GAPDH為內(nèi)參來(lái)表示蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 SOX2在不同組織中的表達(dá)SOX2主要在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)棕黃色、深棕色顆粒。正常胎盤(pán)組織中SOX2免疫組化評(píng)分明顯低于子癇前期胎盤(pán)組織[(3.2±0.4)分vs(8.4±1.2)分,P<0.05]，見(jiàn)圖1。

a:子癇前期；b:正常胎盤(pán)組織

2.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)調(diào)控SOX2的基因經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析顯示，miRNA-429、miRNA-200b、miRNA-200c與SOX2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。

2.3聚類分析不同組織中差異表達(dá)的miRNA分別篩選出20個(gè)差異最大的上調(diào)(hsa-miR-302b、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1909、hsa-miR-19b-1、hsa-miR-33b、hsa-miR-518e、hsa-miR-376a、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29a、hsa-miR-1274b、hsa-miR-625、hsa-miR-658、hsa-miR-1206、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-138-2、hsa-miR-617、hsa-miR-105、hsa-miR-1234)和下調(diào)(hsa-miR-449b、hsa-miR-1248、hsa-miR-1260、hsa-miR-1266b、hsa-miR-720、hsa-miR-221、hsa-miR-136、hsa-miR-200b、hsa-miR-936、hsa-miR-892a、hsa-miR-570、hsa-miR-1251、hsa-miR-101、hsa-miR-589、hsa-miR-143、hsa-miR-603、hsa-miR-1539、hsa-miR-1825、hsa-miR-585、hsa-miR-208b)的 miRNA。

2.4RT-qPCR檢測(cè)分析miRNA-200b在不同胎盤(pán)組織中的表達(dá)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA-200b對(duì)SOX2具有調(diào)控作用，且高通量測(cè)序聚類分析結(jié)果中miRNA-200b在不同組織中存在差異，所以本研究選取miRNA-200b進(jìn)行進(jìn)一步的研究。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常胎盤(pán)組織miRNA-200b表達(dá)量(1.02±0.08)比較，子癇前期胎盤(pán)組織(0.25±0.05)明顯降低(P<0.05)。

2.5雙熒光素酶基因報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-200b與SOX2的關(guān)系雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miRNA-200b明顯抑制野生型SOX2的熒光素酶活性(P<0.05)，說(shuō)明miRNA-200b與SOX2具有靶向調(diào)控關(guān)系。見(jiàn)圖2。

與minic-NC比較，*P<0.05

2.6miRNA-200b與SOX2對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載組侵襲細(xì)胞數(shù)量相比， miRNA-200b組和sh-SOX2組明顯下降(P<0.05)；與miRNA-200b組侵襲細(xì)胞數(shù)量相比，miRNA-200b+SOX2組明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。

2.7miR-200b與SOX2對(duì)HTR8-SVneo細(xì)胞遷移能力的影響miRNA-200b組、sh-SOX2組細(xì)胞遷移率較空載組明顯下降(P<0.05)；與miRNA-200b組細(xì)胞遷移率比較，miRNA-200b+SOX2組明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)圖5、圖6。

2.8Western blot檢測(cè)SOX2、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)水平SOX2與MMP2、MMP9蛋白存在相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖7。 miRNA-200b組、sh-SOX2組中SOX2、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)較空載組明顯下降(P<0.05)；miRNA-200b+SOX2組SOX2、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)較miRNA-200b組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖8、表1。

a:空載組; b:miRNA-200b組; c:sh-SOX2組; d:miRNA-200b+SOX2組

與空載組比較，*P<0.05；與miRNA-200b組比較，#P<0.05

圖示miRNA-200b+SOX2組細(xì)胞遷移率較miRNA-200b組明顯增多

與空載組比較，*P<0.05；與miRNA-200b組比較，#P<0.05

圖 7 生物信息預(yù)測(cè)SOX2與MMP2 、MMP9的關(guān)系

1:空載組; 2:miRNA-200b組; 3:sh-SOX2組; 4:miRNA-200b+SOX2組

表 1 不同組別SOX2、MMP2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞具有氣體交換、供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)、代謝廢物、血管重建等多種功能，細(xì)胞合體和浸潤(rùn)遷徙是滋養(yǎng)層細(xì)胞分化的重要路徑[10]。子癇前期的發(fā)生不僅直接導(dǎo)致母體多種系統(tǒng)的損傷，增加母體呼吸窘迫、產(chǎn)后初血以及腎功能衰竭和羊水栓塞等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且增加胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)的發(fā)生概率[11]。子癇前期的發(fā)生與滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)增殖和侵襲功能缺陷密切相關(guān)[10]。因此明確滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲功能的具體調(diào)節(jié)機(jī)制在臨床上具有重要意義。

SOX2基因定位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂3.3-27結(jié)構(gòu)域內(nèi)，含有317個(gè)氨基酸，由于糖基化修飾，相對(duì)分子量為46×103[12]。SOX2作為一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)行為，在早期胚胎發(fā)育、器官生成、維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)和再生以及腫瘤的發(fā)生等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在快速增殖以發(fā)生遷移期的細(xì)胞中高表達(dá)，例如SOX2在上皮閉合過(guò)程中高表達(dá)，促進(jìn)外胚層上皮細(xì)胞遷移，從而修復(fù)早期上皮缺陷[14]。在表皮損傷后向傷口遷移的角質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了SOX2的mRNA水平明顯升高[15]。由于SOX2對(duì)細(xì)胞增具有促進(jìn)作用并可抑制細(xì)胞凋亡，所以在多種腫瘤組織中SOX2均呈高表達(dá)[16]。據(jù)報(bào)道，SOX2表達(dá)水平隨著胚胎發(fā)育逐漸升高，在滋養(yǎng)外胚層中達(dá)到峰值，是胚胎發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵分子[17]。SOX2通過(guò)刺激滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖促進(jìn)囊胚腔的形成，進(jìn)而加速胚胎發(fā)育[18]。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，子癇前期胎盤(pán)中SOX2表達(dá)水平明顯高于正常胎盤(pán)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)的SOX2可能促進(jìn)了滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。為了證實(shí)SOX2對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移能力，本研究以HTR8-SVneo作為研究細(xì)胞模型構(gòu)建了SOX2沉默細(xì)胞株，結(jié)果顯示，與NC相比，沉默SOX2后細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱，說(shuō)明SOX2是影響滋養(yǎng)層細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能關(guān)鍵蛋白之一。

研究表明，miRNA是內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，而多種疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)受到miRNA的調(diào)控作用，影響疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[19]。本研究中通過(guò)檢索targetscan發(fā)現(xiàn)miR-429、miR-200b、miR-200c與SOX2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，采用高通量測(cè)序分析不同胎盤(pán)組織中差異表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)miR-200b為明顯下調(diào)基因。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常胎盤(pán)組織相比，miR-200b在子癇前期胎盤(pán)組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證 miRNA-200b與SOX2具有靶向調(diào)控關(guān)系。研究表明miR200b影響如乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。CHEN等[21]發(fā)現(xiàn)miR-200b在卵巢癌表達(dá)明顯下調(diào)，并能靶向調(diào)控PDK1來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。但miR-200b對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控作用尚無(wú)報(bào)道，本研究中miR-200b過(guò)表達(dá)后SOX2表達(dá)量明顯降低，且細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯降低，而過(guò)表達(dá)SOX2蛋白后能夠逆轉(zhuǎn)HTR8-SVneo細(xì)胞的上述運(yùn)動(dòng)功能，說(shuō)明miR-200b對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷徙和侵襲能力能力可能是通過(guò)對(duì)對(duì)SOX2蛋白的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。

研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞的這一生理過(guò)程是在眾多細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞移動(dòng)分子以及大量的調(diào)控酶的相互協(xié)調(diào)下共同完成的[22]。其中MMPs因其幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的非多糖成分，成為參與細(xì)胞侵襲過(guò)程中重要的效應(yīng)分子。大量的研究表明MMPs與滋養(yǎng)細(xì)胞的病變密切相關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9的活性直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[24]。另?yè)?jù)報(bào)道MMP9的表達(dá)量直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)胚胎的侵襲細(xì)胞數(shù)量[25]。研究顯示侵襲相關(guān)分子MMP2和MMP9的表達(dá)在子癇前期的病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用[26]。本研究采用生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)SOX2能調(diào)控MMP2和MMP9的表達(dá)，下調(diào)SOX2的表達(dá)后，MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)均明顯降低，推斷SOX2在子癇前期中通過(guò)調(diào)控MMP2和MMP9的表達(dá)來(lái)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

綜合上述，SOX2在子癇前期患者的胎盤(pán)組織中表達(dá)量異常升高，SOX2蛋白可能受miR-200b的調(diào)節(jié)而靶向調(diào)控MMP2和MMP9的表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力。