艾滋病病毒血漿控制者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析

張 之，胡海洋，葛 尤，盧 靜，周 瑩，徐曉琴，邱 濤，傅更鋒

0 引 言

艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性降低，其他淋巴細(xì)胞亞群亦存在不同程度的異常。部分HIV感染者在不經(jīng)過(guò)抗病毒治療的前提下，依然能夠在5年以上的時(shí)間維持較高的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和較低的病毒載量(<2000 copies/mL)，這類人群被稱為HIV血漿控制者[1-2]。血漿控制者為研究機(jī)體抗HIV的免疫機(jī)制提供了模型，已成為世界艾滋病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。早期研究將血漿控制者抗HIV 的機(jī)制歸因于缺陷病毒的感染[3-4]或宿主趨化因子受體多態(tài)性(如CCR5-Δ32、CCR2-64I等)[5-6]，但是后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血漿控制者中具有完全復(fù)制能力的病毒株[7]，并且宿主趨化因子受體多態(tài)性在不同的人種中也存在著分布不均。上述結(jié)果表明病毒基因突變和宿主基因多態(tài)性無(wú)法完全解釋這一現(xiàn)象，宿主免疫系統(tǒng)可能也是血漿控制者抗HIV感染的重要原因之一[8]。

因此，了解血漿控制者體內(nèi)免疫狀況，對(duì)揭示其免疫防御機(jī)制具有重要意義。但由于血漿控制者樣本獲得的稀缺性，目前對(duì)血漿控制者機(jī)體免疫機(jī)制的研究仍然較少。有效清除病毒感染細(xì)胞需要先天免疫效應(yīng)和適應(yīng)性免疫效應(yīng)的連續(xù)活動(dòng)，這可能與淋巴細(xì)胞各亞群均有關(guān)聯(lián)[8]。本研究旨在通過(guò)對(duì)血漿控制者、慢性感染者以及健康人群外周血淋巴亞群的表達(dá)情況進(jìn)行分析和比較，為進(jìn)一步研究血漿控制者免疫作用機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集江蘇省內(nèi)艾滋病防治基本信息系統(tǒng)2016年1月至2018年12月29例HIV-1抗體陽(yáng)性患者。根據(jù)患者CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量水平分為：血漿控制組[病毒載量≤2000 copies/mL，平均病毒載量(991±887)copies/mL,n=6]、慢性感染組[病毒載量≥2000 copies/mL, 平均病毒載量(52 181±10 180)copies/mL,n=23]，另選取健康人群為對(duì)照組(n=70)。6例血漿控制者中3例B亞型，2例BC亞型，1例AE亞型；23例慢性感染者中3例B亞型，14例BC亞型，6例AE亞型。納入標(biāo)準(zhǔn)： HIV-1抗體確證陽(yáng)性≥5年，且未經(jīng)治療的HIV感染者。排除標(biāo)準(zhǔn)：機(jī)會(huì)性感染等嚴(yán)重合并癥；CCR5△32缺失者。本研究經(jīng)過(guò)江蘇省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：JSJK-B005-02)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1 儀器和試劑FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀及配套CD4+T淋巴細(xì)胞、NK/B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)熒光抗體試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司， Abbott m2000rt熒光定量PCR儀購(gòu)自雅培公司，配套核酸試劑。

1.2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)采集HIV感染者和健康對(duì)照靜脈血5 mL，采用EDTA抗凝，24 h內(nèi)完成T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)的流式檢測(cè)，剩余血樣當(dāng)天離心收集血漿-80 ℃保存，30 d內(nèi)完成HIV病毒載量檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況3組年齡、性別和傳播途徑分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 入組研究對(duì)象的基本情況

2.2淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)水平的比較血漿控制組、慢性感染組CD4+T 、CD8+T計(jì)數(shù)明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)，血漿控制組CD4+T計(jì)數(shù)明顯高于慢性感染者組(P<0.05)，血漿控制組與慢性感染組CD8計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。慢性感染組NK細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4/CD8比值明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)。血漿控制組與健康對(duì)照組B細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4/CD8比值明顯高于慢性感染組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表 2 血漿控制者、慢性感染者與健康對(duì)照者外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較

2.43組間淋巴細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性血漿控制組外周血CD4+、B和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)之間兩兩呈正相關(guān)(P<0.05)；慢性感染組NK與CD4+、B細(xì)胞呈正相關(guān)(P<0.05)；而健康對(duì)照組僅B細(xì)胞與CD4+呈正相關(guān)(P<0.05)；慢性感染組和健康對(duì)照組中CD8+與CD4+細(xì)胞呈弱正相關(guān)(P<0.05)。血漿控制組各亞群之間的r值高于慢性感染組和健康對(duì)照組。見(jiàn)表3，圖1。

表 3 血漿控制者、慢性感染者和健康對(duì)照外周血淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)系數(shù)

a、b、c:血漿控制組； d、e、f：慢性感染組； g、h：健康對(duì)照組

3 討 論

淋巴細(xì)胞亞群通過(guò)發(fā)揮不同功能，在人體免疫功能調(diào)節(jié)中起到免疫監(jiān)視效果，并發(fā)揮著重要作用，機(jī)體免疫狀況可以通過(guò)淋巴細(xì)胞亞群分布反映出來(lái)[9-10]。其各亞群之間的平衡狀態(tài)與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。在未經(jīng)治療的HIV感染者中，其體內(nèi)的病毒不斷復(fù)制，會(huì)引起所有主要淋巴細(xì)胞群的紊亂，包括B細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+和CD8+細(xì)胞[11-13]，導(dǎo)致異常的免疫激活。

T淋巴細(xì)胞有輔助、殺傷和抑制功能。本研究中，慢性感染者的T淋巴細(xì)胞亞群的變化與其他研究結(jié)論高度一致[18]，CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞升高，符合HIV感染的一般進(jìn)程表現(xiàn)。而血漿控制者組雖然也有類似結(jié)果，但CD4+T淋巴細(xì)胞水平卻明顯高于慢性感染者，表明CD4+T淋巴細(xì)胞的受損程度低于慢性感染者。這可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表達(dá)相對(duì)降低有關(guān)[20]，也有可能與CAF (CD8+cell antiviral factor)介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的非細(xì)胞毒性抗病毒反應(yīng)有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)血漿控制者CD4+/CD8+比值低于健康對(duì)照但高于慢性感染者，這說(shuō)明3組間免疫激活程度不同，血漿控制者的免疫激動(dòng)狀態(tài)與慢性感染者存在一定差異。此外，有研究表明，具有控制病毒能力的 CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞的水平在HIV 潛伏感染緩慢降低，雖然 CD8+T 細(xì)胞數(shù)量仍然高于正常，但其功能卻進(jìn)一步下降[22-23]，這提示我們可以進(jìn)一步對(duì)血漿控制者外周血中CD8+、CD28+T淋巴細(xì)胞水平進(jìn)行研究，探索其升高的CD8+T細(xì)胞控制病毒的能力以及對(duì)CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能。另外，T細(xì)胞活化水平越高,其凋亡速度也越快[22]，導(dǎo)致 T淋巴細(xì)胞的高易感性和易耗竭[24]，血漿控制者T細(xì)胞活化程度也值得進(jìn)一步探索。

B細(xì)胞和NK細(xì)胞分別是體液免疫和固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞。有研究顯示在HIV感染中，B細(xì)胞的總頻率降低，而凋亡誘導(dǎo)的B細(xì)胞死亡增加是HIV感染過(guò)程中B細(xì)胞減少的重要原因[15]。B細(xì)胞通過(guò)抗原提呈、分泌細(xì)胞因子和抗體等功能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[25]。本研究中慢性感染者B細(xì)胞數(shù)量低于健康人群，而血漿控制者B細(xì)胞總數(shù)和健康人群無(wú)異，且高于慢性感染者，提示血漿控制者B細(xì)胞數(shù)量并未受損，可能并未出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象，但是其亞群和功能是否受損，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。HIV感染后，NK細(xì)胞也受到一定程度的破壞，其數(shù)量和亞群均受到影響。NK細(xì)胞是機(jī)體防御病毒和腫瘤的天然屏障，它能分泌細(xì)胞毒因子和顆粒酶穿孔素而殺傷被感染的靶細(xì)胞[13]。本研究結(jié)果中慢性感染者NK細(xì)胞數(shù)量低于健康人群，而血漿控制者NK細(xì)胞水平則與健康人群無(wú)異，表明血漿控制者NK細(xì)胞的功能受損程度低于慢性感染者。

本研究血漿控制者中，CD4+細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞之間呈現(xiàn)高度的正相關(guān)性，在慢性感染者和健康對(duì)照中其相關(guān)性或有或弱，提示血漿控制者淋巴細(xì)胞亞群之間可能存在積極的相互促進(jìn)關(guān)系。有研究表明，B細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞存在穩(wěn)態(tài)效應(yīng)[26]，CD4+T細(xì)胞代表T輔助細(xì)胞亞群(Th)，具有輔助B細(xì)胞及誘導(dǎo)其他細(xì)胞亞群的活化的作用，在免疫調(diào)節(jié)中，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫平衡的維持具有樞紐的功能，而 B細(xì)胞作為APC也可給CD4+T細(xì)胞提供活化和共刺激信號(hào)[27]。有學(xué)者提出，HIV感染病毒血癥者B細(xì)胞輔助T細(xì)胞活化和增殖的能力比健康人和無(wú)病毒血癥者更低，而CD4+T細(xì)胞活化后通過(guò)CD40L輔助B細(xì)胞增殖的能力受損[28]。而本次研究結(jié)果則間接支持了這一研究結(jié)論，健康人群中，CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞存在一定的正相關(guān)；在慢性感染者中，CD4+T細(xì)胞活化增殖能力降低，不能有效刺激B細(xì)胞增殖，與B細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性消失，但是，在血漿控制者中，CD4+T細(xì)胞與B細(xì)胞高度正相關(guān)，意味著CD4+T細(xì)胞輔助B細(xì)胞增殖的能力比健康人群要強(qiáng)。但是這一推論仍需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究去驗(yàn)證。血漿控制者中NK細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制尚不明確，本研究為觀察性研究，不同研究對(duì)象的淋巴細(xì)胞亞群改變與疾病進(jìn)程之間的關(guān)系只能得出存在相關(guān)性的結(jié)論，尚無(wú)法推論出因果關(guān)系，值得更進(jìn)一步的探索。

目前所有的治療方法尚無(wú)法徹底清除所有病毒，只能達(dá)到功能性治愈，即將病毒載量水平抑制在極低的水平。深入了解血漿控制者各淋巴亞群的功能情況及相互作用機(jī)制，或?qū)⒛軌蛱剿鞲鼉?yōu)化的先天免疫效應(yīng)和適應(yīng)性免疫效應(yīng)的免疫應(yīng)答模式，為艾滋病的免疫功能治療提供新的思路。