地塞米松誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂發(fā)生中相關(guān)差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

郭佳男，劉 濤，何 葦

0 引 言

唇腭裂是人類最常見的先天性頜面部發(fā)育畸形之一，該缺陷不僅會(huì)影響患兒面容美觀、進(jìn)食吞咽和語(yǔ)音功能，而且會(huì)影響患兒的心理和社會(huì)交往。臨床上根據(jù)是否伴有其他系統(tǒng)畸形或先天發(fā)育異常將其分為綜合征型唇腭裂和非綜合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip and/orpalate, NSCL/P)[1]。有報(bào)道表明NSCL/P的發(fā)病率根據(jù)研究對(duì)象的地理位置、種族、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位的差異而略有不同[2]，在國(guó)內(nèi)活產(chǎn)兒中的發(fā)病率大約為1.62‰，略高于西方國(guó)家1.42‰的發(fā)病率[3-4]。

從病因?qū)W角度來(lái)看，越來(lái)越多的證據(jù)表明唇腭裂的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果[5]。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)是一種常用的免疫抑制劑，有時(shí)候臨床上孕婦不可避免要使用到GC，但研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量GC可改變胚胎腭的發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)腭裂的發(fā)生[6]。而地塞米松(dexamethasone, DEX)與其他種類GC相比，誘導(dǎo)胚胎腭裂的發(fā)生率較高，但胚胎致死率很低，是一種較為理想的腭裂動(dòng)物建模環(huán)境刺激因素[7]。因此，深入解析DEX誘導(dǎo)腭裂發(fā)生的作用機(jī)制，對(duì)于降低NSCL/P的發(fā)病率具有重大的研究意義和臨床價(jià)值，但目前對(duì)于DEX導(dǎo)致腭裂發(fā)生的機(jī)制尚不十分清楚。

之前對(duì)于DEX誘導(dǎo)腭裂發(fā)生機(jī)制的研究都是從單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因水平進(jìn)行的，缺少基因表達(dá)整體觀。而RNA測(cè)序是近年來(lái)快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)，具有信噪比高、分辨率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，能從全局的角度了解基因的表達(dá)情況和變化規(guī)律，為全面認(rèn)識(shí)基因的功能和基因間的相互關(guān)系提供線索[8]。本研究利用RNA測(cè)序技術(shù)，擬建立DEX導(dǎo)致NSCL/P相關(guān)的DEGs變化為線索的調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)框架，并通過(guò)對(duì)其進(jìn)行基因功能和信號(hào)通路富集分析，探討DEX干預(yù)對(duì)小鼠胚胎頜面部組織的基因改變影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)10周齡、體重20 g以上C57BL/6J野生型小鼠(斯貝福生物技術(shù)有限公司，北京)，許可證號(hào)：SCXK (京) 2018-0010，光照/黑暗各12 h，自由攝取飲用水及飼料，室溫調(diào)節(jié)至18～25 ℃，相對(duì)濕度調(diào)節(jié)至20%～30%，空調(diào)保持通風(fēng)以減少氨氣濃度，定期檢查并更換清潔墊料，及時(shí)補(bǔ)充飲用水及飼料，并對(duì)其生理狀況和行為進(jìn)行監(jiān)測(cè)。DEX(索萊寶公司，北京)；Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))；RNA later(Invitrogen，美國(guó))；SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，日本)；Prime ScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，日本)；引物合成(吉?jiǎng)P基因，上海)。

1.2DEX誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂模型的建立按照何葦?shù)萚9]的方法構(gòu)建模型，17:00將C57BL/6J小鼠按照雌雄比2∶1合籠交配，于次日上午8點(diǎn)檢查小鼠孕栓，發(fā)現(xiàn)孕栓者標(biāo)記為胚胎第0.5天(E0.5)。E10.5時(shí)按隨機(jī)數(shù)字表法將孕鼠分為DEX組和等滲鹽水組，DEX組按照6 mg/kg的濃度腹腔注射DEX(DEX預(yù)先溶于等滲鹽水中，于E10.5-12.5每天同一時(shí)間連續(xù)注射3 d)，等滲鹽水組則按照同樣劑量和同樣時(shí)間腹腔注射等滲鹽水，于E14.5收集樣本。

1.3樣本的收集與處理頸椎脫臼法處死E14.5孕鼠，剖宮取出胚胎。將DEX組與等滲鹽水組各收集9只孕鼠的胚胎頜面中部組織(將小鼠完整頭部去除下頜、舌以及眼部之上的腦部組織)，隨機(jī)將每3只孕鼠的胚胎頜面部中部組織作為一個(gè)樣本，得到約為黃豆大小組織塊，用PBS液清洗干凈，放入相當(dāng)于組織塊5倍體積RNA later的離心管中孵育過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.4總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)待樣本收集完成，使用Bio PulverizerTM冰凍粉碎組織，加 1mL的RNA抽提試劑Trizol，使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。使用Nanodrop公司分光光度計(jì)測(cè)定RNA在分光度260及280 nm的吸光度值，以保證提取的RNA符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA測(cè)序分析技術(shù)服務(wù)由上海烈冰科技有限公司提供。

1.5構(gòu)建RNA文庫(kù)及深度測(cè)序獲取符合要求的總RNA后，使用鏈霉親和素磁珠從1 μg RNA中提取全部帶poly(A)尾的RNA，隨機(jī)打斷成片段，以mRNA片段為模板逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，通過(guò)末端修復(fù)加工雙鏈DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物熱變性形成單鏈，單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫(kù)，最后利用Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)的雙端測(cè)序。定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)提取E14.5胎鼠腭突mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR驗(yàn)證4個(gè)DEGs(表達(dá)升高和表達(dá)降低的代表基因各2個(gè))組間表達(dá)差異，引物序列如下：LC3引物序列正義鏈為5′-gcctgtcctggataagacca-3′，反義鏈為5′-ccgtcttcatccttctcctg-3′；Beclin-1引物序列正義鏈為5′-ggccaataagatgggtctga-3′，反義鏈為5′-gctgcacacagtccagaaaa-3′；PCNA引物序列正義鏈為5′-gtggagcaacttggaatccc-3′，反義鏈為5′-ggttaccgcctcctcttctt-3′；Cyclin D1引物序列正義鏈為5′-agaagtgcgaagaggaggtc-3′，反義鏈為5′-ttctcggcagtcaagggaat-3′。采用96孔板，配制10 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，dH2O3μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用2△△Ct方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6基因差異表達(dá)分析對(duì)原始數(shù)據(jù)用Feature Extraction software 10.7讀取后采用Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile。采用Fold-change(FC)法及t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)DEGs進(jìn)行篩選。挑選條件如下：FC≤0.5或者FC≥2，t檢驗(yàn)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。利用篩選差異倍數(shù)(FC值)以及t檢驗(yàn)得到的P值2個(gè)因素共同繪制火山圖，再對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO及KEGG分析。

2 結(jié) 果

2.1DEX導(dǎo)致小鼠胚胎腭裂模型的構(gòu)建DEX干預(yù)后，可見E17.0新生小鼠胚胎腭突發(fā)育不足，無(wú)法融合導(dǎo)致腭裂發(fā)生，而等滲鹽水組小鼠腭部正常融合。

2.2差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果原始序列經(jīng)過(guò)處理后，2組樣本所獲得的可用于分析的基因數(shù)量分別平均為23 328個(gè)。測(cè)序篩選出表達(dá)差異大于2倍的基因共有796個(gè)，其中有492條表達(dá)上調(diào)，表達(dá)下調(diào)的304條。部分差異倍數(shù)較大基因見表1，火山圖見圖1。

表 1 異常表達(dá)基因部分結(jié)果

紅色區(qū)域：P<0.05且FC≥2的差異基因；藍(lán)色區(qū)域：P<0.05且FC≤0.5的差異基因

2.3差異表達(dá)基因的GO功能顯著性分析通過(guò)對(duì)篩選出來(lái)的DEGs進(jìn)行GO功能分析，可知DEGs

主要涉及多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化和細(xì)胞黏附等生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)enrich factor值的大小，按降序排列作圖，取前20個(gè)結(jié)果，見圖2。

圖 2 GO富集圖

2.4差異表達(dá)基因的通路顯著性富集分析將DEGs以P<0.05為篩選條件進(jìn)行KEGG pathway分析，結(jié)果顯示DEGs可能涉及PI3K-AKT、Wnt及Hedgehog等信號(hào)通路，這與之前的研究結(jié)果相吻合。根據(jù)enrich factor值的大小，按降序排列作圖，取前20個(gè)結(jié)果，見圖3。

圖 3 Pathway富集圖

2.5q-PCR驗(yàn)證對(duì)4條目的基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示LC3和Beclin-1基因表達(dá)上調(diào)，PCNA和CyclinD1基因表達(dá)下調(diào)。4條DEGs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的變化趨勢(shì)與高通量測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致，提示該測(cè)序結(jié)果可靠，驗(yàn)證結(jié)果見表2。

表 2 qPCR驗(yàn)證各基因相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

環(huán)境因素與NSCL/P發(fā)生的相關(guān)研究一直局限于單個(gè)或少數(shù)基因，如Lan等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在DEX作用下，小鼠胚胎腭突組織中成骨基因GATA6和BMP2表達(dá)水平降低，凋亡蛋白bax和caspase3表達(dá)水平升高，表明DEX可以抑制腭突成骨及促進(jìn)腭突細(xì)胞凋亡。Ma等[11]的研究則發(fā)現(xiàn)DEX可下調(diào)PAR3/PAR6/aPKC的表達(dá),表明DEX可通過(guò)抑制小鼠胚胎腭的PAR復(fù)合體，干擾內(nèi)側(cè)緣上皮細(xì)胞的PAR復(fù)合體和細(xì)胞極性，從而導(dǎo)致腭融合失敗。但是，這些實(shí)驗(yàn)僅僅揭開了DEX誘導(dǎo)腭裂發(fā)生機(jī)制的冰山一角，目前對(duì)DEX誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然很不充分。近些年來(lái)，已有學(xué)者利用RNA測(cè)序、關(guān)聯(lián)分析等生物信息學(xué)方法來(lái)研究DEX干預(yù)帶來(lái)的影響，這些研究涉及血管生成、肝代謝、藥物不良反應(yīng)等多個(gè)生理過(guò)程[12-14]。然而當(dāng)前對(duì)于DEX誘導(dǎo)NSCL/P的DEGs的整體性研究尚未見報(bào)道。而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致的全貌分析成為可能。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)成功篩選到一些與DEX誘導(dǎo)NSCL/P相關(guān)的DEGs，為NSCL/P病因的研究提供了新的思路和工作基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)分析方法是當(dāng)代分子生物學(xué)研究的重要工具，它能方便快捷地預(yù)測(cè)疾病相關(guān)mRNAs的功能及通過(guò)哪些相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生變化，因此可以從立體角度觀察多致病因素對(duì)疾病發(fā)生的影響，對(duì)于病因十分復(fù)雜的先天性疾病的致病機(jī)制研究提供宏觀視角。本研究通過(guò)RNA高通量測(cè)序結(jié)合生信分析，篩選出DEX誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂發(fā)生中相關(guān)DEGs并對(duì)其進(jìn)行功能分類，推測(cè)這些基因在DEX誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂發(fā)生中的功能和作用。本研究發(fā)現(xiàn)DEX組樣本中有796個(gè)mRNAs呈顯著性差異表達(dá)，其中492個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，304個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)。對(duì)部分基因的qPCR驗(yàn)證結(jié)果也證實(shí)了與高通量測(cè)序結(jié)果相一致的DEGs表達(dá)變化。

腭的發(fā)育是一個(gè)連續(xù)且精密的過(guò)程，其中任何一步受到干擾都有可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生[15]，大量研究發(fā)現(xiàn)在此過(guò)程中許多細(xì)胞表型都可能出現(xiàn)異常，比如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞黏附等[16-19]，我們通過(guò)對(duì)DEX誘導(dǎo)NSCL/P發(fā)生相關(guān)DEGs進(jìn)行GO分析顯示以上幾種生物學(xué)過(guò)程異常均參與DEX誘導(dǎo)的腭裂發(fā)生。同樣，NSCL/P的發(fā)生發(fā)展也涉及到多種信號(hào)通路，對(duì)任一通路傳導(dǎo)障礙的調(diào)控都可能對(duì)治療NSCL/P起到重要作用。如Wnt信號(hào)通路和Hh信號(hào)通路已被普遍認(rèn)為參與NSCL/P的發(fā)生[20-21]，本研究中DEGs所涉及的通路眾多，且上述幾條重要通路均包含在內(nèi)。

綜上，DEX對(duì)小鼠胚胎面中份區(qū)域的影響涉及細(xì)胞發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、分子結(jié)合等多個(gè)方面，擬為后期進(jìn)行具體靶標(biāo)基因的功能驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制建立前期基礎(chǔ)和推測(cè)依據(jù)。