推拿對失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌特異性microRNA和肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子的影響

重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市 400016

周圍神經(jīng)損傷后，骨骼肌失去神經(jīng)支配，出現(xiàn)肌萎縮[1-2]，目前主要治療手段是神經(jīng)修復(fù)術(shù)。由于神經(jīng)生長速度緩慢，在軸突達(dá)到靶器官前，肌肉會處于持續(xù)萎縮狀態(tài)[3]。在神經(jīng)重建前延緩肌萎縮程度，對肌肉功能恢復(fù)有重要價值。

肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化是萎縮肌肉修復(fù)再生的基石[4]。肌肉受損后，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活，增殖分化為新生肌纖維參與骨骼肌再生與修復(fù)[5]。其中配對盒轉(zhuǎn)錄因子(paired box transcription factor 7,Pax7)是維持肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖水平的重要標(biāo)志分子。肌肉受損后，Pax7表達(dá)上調(diào)，激活肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化。成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)和肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)是肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是Pax7 的下游分子；MyoD 為初級分化因子，主要調(diào)控成肌分化；MyoG 為次級分化因子，主要調(diào)控肌管終末分化形成成熟肌纖維[6]。microRNA是涉及轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一類非編碼RNA，其中microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 為肌特異性microRNA，對Pax7、MyoD、MyoG 的表達(dá)具有調(diào)控作用[7]。

推拿是中醫(yī)的重要組成部分，對骨和軟組織損傷有很好療效[8-9]。本研究觀察推拿對失腓總神經(jīng)大鼠腓腸肌中microRNA-133a、microRNA-206、microRNA-1、Pax7、MyoD、MyoG 表達(dá)的影響，從肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的角度探討推拿干預(yù)失神經(jīng)肌萎縮的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF 級健康雄性Sprague-Dawley 大鼠42 只，體質(zhì)量(270±10) g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(川)2015-030。分籠飼養(yǎng)，室溫(22±2) ℃，相對濕度(60±5)%，明暗12 h 交替，飲食水自由攝取。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，大鼠編號，計(jì)算機(jī)自動生成42個兩位數(shù)的隨機(jī)數(shù)字表，每個編號對應(yīng)一個隨機(jī)數(shù)字，再按隨機(jī)數(shù)字的大小重新排列，序號1～6 為假手術(shù)組(n=6)，7～25 為模型組(n=18)，26～42 為推拿組(n=18)。

實(shí)驗(yàn)中對動物的處置均遵照重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，RR047A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Trizol 總RNA 提取液，Pax7、MyoD1、MyoG、microRNA-1、microRNA-133a、microRNA-206 引 物合成：日本TAKARA 公司。柔軟型大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。AL204 型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司。低溫高速離心機(jī)：美國SIGMA 公司。ThermoND 2000 超微量核酸蛋白測定儀：上海GENE 公司。T100TM聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、CFXPCR 檢測系統(tǒng)：美國BIO RAD 公司。冰凍切片機(jī)：德國LEICA 公司。CellSens Standard 圖像采集軟件、BX53 正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。AFY-10型小動物按摩器：天津愛福依科技有限公司。RPM薄膜壓力測試儀：上海邑成測試設(shè)備有限公司。

1.3 造模

大鼠10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉，無菌條件下右股外側(cè)切口，鈍性分離肌肉，暴露脛神經(jīng)并游離。模型組和推拿組切除腓總神經(jīng)約1 cm；假手術(shù)組只暴露神經(jīng)，不離斷[10]。逐層縫合后自由進(jìn)食、飲水。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后第2天起，推拿組以柔軟型大鼠固定器固定，待情緒穩(wěn)定后，將動物按摩器按摩頭固定于術(shù)側(cè)下肢，RPM 薄膜壓力測試儀測試，縱向壓力5 N，轉(zhuǎn)速2600 r/min，時長15 min，每天1 次[10]。假手術(shù)組和模型組僅固定，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5 檢測方法

模型組和推拿組分別于術(shù)后14 d、21 d、28 d，隨機(jī)數(shù)字表法取6 只大鼠，頸椎脫臼法處死。假手術(shù)組于術(shù)后28 d同法一次性處死。

1.5.1 腓腸肌濕重比測定

從股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)到跟骨結(jié)節(jié)處完整取下雙側(cè)腓腸肌，吸干表面殘留液體，立即電子天平稱量濕重，計(jì)算腓腸肌濕重比(術(shù)側(cè)/非術(shù)側(cè))。

術(shù)側(cè)腓腸肌組織分為兩份，一份快速液氮冷凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫硪环?%多聚甲醛固定，包埋，行形態(tài)學(xué)檢測。

1.5.2 組織學(xué)觀察

腓腸肌4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，浸蠟包埋后，石蠟切片，厚3 μm，行HE 染色。隨機(jī)取3張切片，400倍光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取4 個視野拍照，每個視野選20 個細(xì)胞，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算腓腸肌細(xì)胞直徑和面積。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量PCR

冰凍保存的腓腸肌60 mg，置于2.0 ml 無酶EP 管中，Trizol 法提取總RNA，超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA 濃度和純度后定量，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配制反應(yīng)體系，置于T100TMPCR 儀中反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Green 法配制反應(yīng)體系，行定量PCR，并讀取Ct值。以β-actin為Pax7、MyoD、MyoG內(nèi)參，以u6 為microRNA-1、microRNA-133a、microRNA-206的內(nèi)參，計(jì)算目的基因2-ΔΔCt。引物序列如下。

Pax7：上游5'-GCA GTC GGA CCA CAT TCA CG-3'；下游5'-GCA CGA CGG TTA CTG AAC CAG A-3'。

MyoG：上游5'-CCA GAC TAC CCA CCG TCC ATT-3'；下游5'-CTG AGT TTG CCC CGT TGA GG-3'。

MyoD：上游5'-CGC CTG AGC AAA GTG AAC GA-3'；下游5'-CAG ACC TTC AAT GTA GCG GAT G-3'。

microRNA-206：上游5'-CTG GAA TGT AAG GAA GTG TGT GG-3'；下游5'-ACA CTT CCT TAC ATT CCA GCC-3'。

microRNA-133a：上游5'-TGG TCC CCT TCA ACC AGC TG-3'；下游5'-TGG TTG AAG GGG ACC AAA GCC-3'。

microRNA-1：上游5'-GGC TGG AAT GTA AAG AAG TGT GTA T-3'；下游5'-ATA CAC ACT TCT TTA CAT TCC AGC C-3'。

β-Actin：上游5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

u6：上游5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'；下游5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕重比

各時間點(diǎn)模型組和推拿組腓腸肌濕重比均小于假手術(shù)組(P＜0.05)，并呈下降趨勢；推拿組各時間點(diǎn)腓腸肌濕重比均高于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腓腸肌濕重比較

2.2 HE染色

假手術(shù)組肌細(xì)胞大小正常，肌纖維排列正常；模型組和推拿組時間延長，肌纖維排列逐漸混亂，肌細(xì)胞截面積逐漸減??；模型組較推拿組變化明顯。見圖1。

除14 d 時推拿組肌細(xì)胞面積與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)外，各個時間點(diǎn)模型組和推拿組肌細(xì)胞面積和直徑均小于假手術(shù)組(P＜0.05)，并呈下降趨勢；推拿組各個時間點(diǎn)肌細(xì)胞面積和直徑均高于模型組(P＜0.05)。見表2、表3。

2.3 PCR

模型組和推拿組Pax7表達(dá)均呈下降趨勢。模型組14 d時Pax7表達(dá)高于假手術(shù)組(P＜0.05)，21 d時與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)，28 d 時低于假手術(shù)組(P＜0.05)；推拿組14 d 和21 d 時Pax7 表達(dá)高于假手術(shù)組(P＜0.05)，28 d 時與假手術(shù)組無顯著性差異(P＞0.05)；各時間點(diǎn)Pax7 表達(dá)均高于模型組(P＜0.05)。見表4。

模型組和推拿組MyoD 和MyoG 表達(dá)均呈先上升后下降趨勢。各時間點(diǎn)模型組和推拿組MyoD 和MyoG 表達(dá)均高于假手術(shù)組(P＜0.05)；除14 d 時MyoG 表達(dá)外，推拿組各時間點(diǎn)MyoD 和MyoG 表達(dá)量高于模型組(P＜0.05)。見表5、表6。

表2 各組腓腸肌肌細(xì)胞直徑比較(μm)

表3 各組腓腸肌肌細(xì)胞面積比較(μm2)

表4 各組腓腸肌Pax7表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

表5 各組腓腸肌MyoD表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

圖1 各組腓腸肌細(xì)胞形態(tài)(HE染色,×400)

模型組和推拿組microRNA 表達(dá)僅取21 d 時的數(shù)據(jù)。21 d 時，模型組和推拿組microRNA-1 和microRNA-133a 表達(dá)均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，microRNA-206 表達(dá)高于假手術(shù)組(P＜0.05)；推拿組microRNA-1、microRNA-133a 和microRNA-206 表達(dá)均高于模型組(P＜0.05)。見表7。

表6 各組腓腸肌MyoG表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

表7 21 d時各組腓腸肌各microRNA表達(dá)比較(2-ΔΔCt)

3 討論

推拿治療肌肉萎縮有著悠久歷史。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，推拿促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)的分子生物學(xué)機(jī)制也逐步被認(rèn)識[8]。我們前期已分別從細(xì)胞自噬[10]和蛋白質(zhì)降解[11]兩個方面證明推拿具有延緩失神經(jīng)肌萎縮的作用。本實(shí)驗(yàn)將從肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的角度，探討推拿延緩失神經(jīng)肌萎縮的效應(yīng)。

肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌肉組織的干細(xì)胞，是肌肉自我修復(fù)再生的基石[12]。骨骼肌受損后，肌衛(wèi)星細(xì)胞被立即激活，并在24 h 內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂，這時，Pax7是靶向上調(diào)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子[13-14]。Pax7的下游是負(fù)責(zé)肌衛(wèi)星細(xì)胞向肌源性分化的肌源性調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)[15]，MyoD 和MyoG 都是MRFs 家族成員[16-17]。Pax7 可通過直接結(jié)合MyoD 遠(yuǎn)端增強(qiáng)元件和近端啟動子，誘導(dǎo)MyoD 表達(dá)，使肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為扁圓形成肌細(xì)胞；MyoD 誘導(dǎo)下游次級分化因子MyoG 表達(dá)，使扁圓形成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，相互融合為肌管，最后成為成熟肌纖維[18-20]。Pax7/MyoD/MyoG 形成的信號通路在失神經(jīng)骨骼肌增殖和分化過程中扮演著重要角色。

研究顯示[21-22]，切斷坐骨神經(jīng)初期，腓腸肌Pax7表達(dá)量是正常大鼠的3～5 倍；隨時間延長，Pax7 表達(dá)進(jìn)行性下降，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖速度也逐漸減慢，最終導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞池耗竭。本研究顯示，在失神經(jīng)初中期，Pax7 的表達(dá)量是正常大鼠的2 倍，之后隨時間推移呈下降趨勢；推拿能有效刺激失神經(jīng)后期Pax7的表達(dá)，提示能促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，延緩肌肉萎縮。

另一方面，腓腸肌中分化相關(guān)因子MyoD 和MyoG 在失神經(jīng)中期表達(dá)最明顯[23]，提示細(xì)胞分化活躍。如肌衛(wèi)星細(xì)胞無法增殖，MyoD 和MyoG 的表達(dá)也會下降[22]。范蕊等[24]電針干預(yù)創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠，也發(fā)現(xiàn)上調(diào)MyoD和MyoG的表達(dá)可減輕腓腸肌萎縮。趙丹丹等[25]發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)失坐骨神經(jīng)大鼠可刺激大鼠腓腸肌產(chǎn)生適應(yīng)性肥大，并刺激MyoD 和MyoG 表達(dá)。本研究顯示，失神經(jīng)21 d 后，MyoD 和MyoG 表達(dá)呈下降趨勢，提示肌衛(wèi)星細(xì)胞分化水平下降；推拿可提高M(jìn)yoD 和MyoG 表達(dá)，可能刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，延緩肌肉萎縮。

microRNA 是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼RNA，與靶基因mRNA 3'UTR 端互補(bǔ)序列結(jié)合后，發(fā)揮調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。已發(fā)現(xiàn)多種microRNA 被證明在肌肉發(fā)生發(fā)育、損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用[26]。其中microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 是肌肉組織特異性表達(dá)的microRNA。敲除microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 會加劇肌肉萎縮[27]。這三種肌特異性microRNA 主要通過對Pax7/MyoD/MyoG 信號通路的調(diào)控，參與骨骼肌修復(fù)[28]。肌生成抑制素8 (growth differentiation factor 8,GDF8)作為microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1的共同靶基因，能抑制Pax7表達(dá)；在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期間，microRNA-133a、microRNA-206 和 microRNA-1 通過抑制GDF8 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對Pax7 的調(diào)控。microRNA-1 和microRNA-206 下調(diào)MyoD 的抑制因子MyoR，從而上調(diào)MyoD 表達(dá)，促進(jìn)成肌分化[29-30]。Nakasa 等[31]發(fā)現(xiàn)，向脛骨前肌損傷模型大鼠局部肌肉注射microRNA-133a、microRNA-206 和microRNA-1 混合物，能有效誘導(dǎo)Pax7、MyoD 和MyoG表達(dá)，促進(jìn)肌肉修復(fù)。劉澤遠(yuǎn)等[30]認(rèn)為，被動運(yùn)動通過促進(jìn)microRNA-1 的表達(dá)，以促進(jìn)MyoD 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，達(dá)到防止失神經(jīng)肌萎縮的作用。何玉童等[32]在體外對小鼠C2C12 成肌細(xì)胞進(jìn)行周期性機(jī)械牽拉，肌特異性microRNA 表達(dá)發(fā)生變化，引起MyoD和MyoG表達(dá)升高。

研究發(fā)現(xiàn)[33]，失神經(jīng)肌肉中肌特異性microRNA誘導(dǎo)會出現(xiàn)延遲：失神經(jīng)早期肌肉還未萎縮，萎縮相關(guān)基因表達(dá)升高，而microRNA 表達(dá)受抑制；失神經(jīng)中后期，肌肉萎縮并開始誘導(dǎo)microRNA 參與萎縮程序的調(diào)控。本團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn)[11]，失神經(jīng)早期和終末期，肌肉中microRNA 表達(dá)不顯著。故本研究僅檢測21 d時microRNA。結(jié)果顯示，推拿組microRNA表達(dá)上升，結(jié)合同時間點(diǎn)Pax7、MyoD 和MyoG 表達(dá)也顯著增加，提示推拿可能通過促進(jìn)肌特異性microRNA的表達(dá)，調(diào)控Pax7/MyoD/MyoG通路。

綜上所述，推拿延緩失神經(jīng)肌萎縮的可能機(jī)制之一是通過上調(diào)肌特異性microRNA 的表達(dá)，促進(jìn)Pax7/MyoD/MyoG 通路轉(zhuǎn)錄，刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，形成新生肌纖維參與肌肉修復(fù)，達(dá)到延緩失神經(jīng)肌萎縮的目的。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。