一株高效溶磷且抑真菌的水生拉恩氏菌MEM40篩選鑒定及其水稻促生研究

孫孝文，馬衛(wèi)，王慧敏

（1.江漢大學(xué) 持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430056；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062）

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化肥的大面積使用，在提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量的同時(shí)也產(chǎn)生了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問題[1]。過量使用化肥容易導(dǎo)致土壤酸化與土壤板結(jié)，加劇環(huán)境水體的污染，土壤菌群多樣性改變，最終導(dǎo)致小麥等農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量下降，甚至可以威脅到人類的健康等問題[2]。因此，科學(xué)施用化肥，提高肥料利用率，減少化肥施用，有效降低化學(xué)肥料對(duì)環(huán)境的危害，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，具有重要的意義[3]。

現(xiàn)如今，植物-微生物協(xié)作提高作物產(chǎn)量，從而替代化肥或者減少化肥的使用是當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[3，4]。其中，植物促生根際細(xì)菌能夠定殖于植物根部、根際土壤以及根的表面，且能夠直接或間接促生植物生長，包含溶磷菌、固氮菌、產(chǎn)生長素（IAA）的細(xì)菌、以及產(chǎn)鐵載體的細(xì)菌等[4]。水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）是一種兼性厭氧，無色素的桿狀細(xì)菌，屬于腸桿菌科，已經(jīng)在各種環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，包括淡水，土壤，植物根際，和冷藏食品[5]植物-微生物相互作用的研究表明，水生拉恩氏菌的一些成員具有溶磷、產(chǎn)IAA和固氮等能力，可作為植物根際促生細(xì)菌為植物的生長發(fā)育提供營養(yǎng)[6]。此外，它們還可作為生物防控制劑，用于防治一些植物病害，包括葡萄藤冠癭病、蘋果火災(zāi)枯萎病和水果貯藏腐爛[7]。

本文從湖北鐘祥稻麥輪作區(qū)水稻根際土壤中篩選到一株植物促生根際細(xì)菌水生拉恩氏菌MEM40。該菌株對(duì)磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉均具有明顯的解磷效果，可對(duì)水稻具有明顯的促生作用。此外，還發(fā)現(xiàn)該菌株可以明顯抑制水稻稻瘟病和小麥赤霉病的病原菌（Magnaporthe oryzae[8]和Fusarium graminearum[9]）。因此，水生拉恩氏菌MEM40是一株高效溶磷且抑真菌的植物促生根際細(xì)菌，對(duì)植物病原真菌防治，提高肥效減少化肥施用具有應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試土樣采集于湖北省鐘祥市磷礦鎮(zhèn)稻麥輪作區(qū)水稻根際土壤。磷酸鈣、磷酸鎂以及其他常用試劑采購于國藥化學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。磷礦粉和市售肥料采購于湖北鄂中生態(tài)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水稻根際土壤溶磷細(xì)菌MEM40的篩選

取水稻根際土壤10.0g，添加至90.0ml磷酸鈣培養(yǎng)基中，30℃、150rpm條件下，震蕩富集培養(yǎng)2天。將富集后的培養(yǎng)液采用梯度稀釋涂布法涂布于磷酸鈣固體培養(yǎng)基平板上，與30℃繼續(xù)培養(yǎng)7天。選取具有明顯溶磷圈的菌落，經(jīng)過多次反復(fù)劃線純化，得到溶磷細(xì)菌MEM40。

1.2.2 水稻根際土壤溶磷細(xì)菌MEM40的鑒定

將溶磷細(xì)菌MEM40單菌落挑取至LB培養(yǎng)基于30℃、150rpm條件下過夜活化。在LB平板上劃線，28℃倒置培養(yǎng)2天后，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)。16SrDNA鑒定方法參考陳玲等方法進(jìn)行。

1.2.3 水稻根際土壤細(xì)菌MEM40溶磷效果測(cè)定

將溶磷細(xì)菌MEM40單菌落挑取至LB培養(yǎng)基于30℃、150rpm條件下過夜活化。以2.0%的接種量分別接種到磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉培養(yǎng)基中，于30℃、150rpm條件下震蕩培養(yǎng)。24h后取4ml樣品，8000rpm離心10min，采用國標(biāo)GB11893-89-鉬酸銨分光光度法測(cè)定上清液中可溶性磷含量。使用pH計(jì)測(cè)定上清液中pH。不加菌液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根際土壤細(xì)菌MEM40的篩選和鑒定

通過梯度稀釋涂布法從稻麥輪作區(qū)水稻根際土壤中篩選到MEM40菌株。菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國，武漢），保藏號(hào)為CCTCCNo.M2018463，全基因組[7]數(shù)據(jù)已公布于NCBI，登錄號(hào)GCA_004328445.1。如圖1A所示，MEM40菌株能在磷酸鈣固體培養(yǎng)基上形成明顯的水解圈，表明MEM40菌株為一株溶磷菌。將MEM40菌株在LB固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2天后，如圖1B所示，MEM40菌落為不透明乳白色，隆起，邊緣齊整。

M E M 4 0 菌株1 6 S r D N A 進(jìn)行多序列比對(duì)后，使用MEGA6.0軟件對(duì)序列相似度較高的相關(guān)典型菌株進(jìn)行聚類分析構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖2所示，MEM40菌株16SrDNA與Rahnella aquatilis CIP 78.65T（CP003244）的16SrDNA序列相似性最高，達(dá)到了99.65%。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)和16SrDNA多序列比對(duì)分析，將MEM40菌株歸屬為Rahnella aquatilis。

2.2 水稻根際土壤細(xì)菌MEM40的溶磷活性

MEM40菌株分別在含有三種難溶性磷酸鹽（磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉）的液體培養(yǎng)基中，以2.0%接種量，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h后，分別測(cè)定了液體培養(yǎng)基中可溶性磷酸鹽含量和pH。如圖3所示，MEM40菌株對(duì)磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉均表現(xiàn)出良好的溶解能力。MEM40菌株對(duì)磷酸鎂溶磷能力最高，其液體培養(yǎng)基中可溶性磷酸鹽含量為380.98±4.01mg/L，pH由初始7.0下降至3.51±0.39。MEM40菌株對(duì)磷酸鈣溶磷能力次之，其液體培養(yǎng)基中可溶性磷酸鹽含量為289.41±15.44mg/L，pH由初始7.0下降至4.26±0.17。MEM40菌株對(duì)磷礦粉溶磷能力最低，其液體培養(yǎng)基中可溶性磷酸鹽含量為155.00±6.78mg/L，pH由初始7.0下降至5.99±0.32。

2.3 水稻根際土壤細(xì)菌MEM40的抑真菌活性

水稻稻瘟病菌和禾谷鐮刀菌分別是水稻稻瘟病和小麥赤霉病的主要病原真菌。如圖4所示，MEM40菌株在PDA平板上可以明顯抑制稻瘟病菌和禾谷鐮刀菌菌絲體的生長。說明MEM40菌株在水稻稻瘟病和小麥赤霉病的防治方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.4 水稻根際土壤細(xì)菌MEM40對(duì)水稻的促生盆栽實(shí)驗(yàn)

水稻促生盆栽實(shí)驗(yàn)種植80天后，將水稻完整挖出，使用清水洗凈泥土并陰干后，測(cè)定了水稻的分蘗數(shù)、株高、鮮重和干重。如表2所示，施加MEM40菌劑實(shí)驗(yàn)組與對(duì)僅施加市售肥料的對(duì)照組相比，水稻分蘗數(shù)增加了11.21%，株高顯著性增加了11.36%，干重顯著性增加了29.11%。施加MEM40菌劑的水稻長勢(shì)明顯優(yōu)于僅施加市售肥料的對(duì)照組。因此，施加MEM40菌劑對(duì)水稻生長具有促進(jìn)作用。

表1 施用MEM40菌株對(duì)水稻生長的影響

3 結(jié)語

本研究在水稻根際土壤中篩選到一株植物根際促生細(xì)菌水生拉恩氏菌MEM40。MEM40菌株具有高溶磷活性，可促進(jìn)水稻生長，具有提高肥料利用率和減少化肥使用量，防止土壤酸化與土壤板結(jié)具有一定的的應(yīng)用潛力。此外，MEM40菌株還具有抑制稻瘟病菌和禾谷鐮刀菌的活性，將有利于植物病原真菌防治，減少農(nóng)藥使用，增加農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。然而，如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)制備MEM40菌劑，以及水稻大田促生實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步研究。