西藏牦牛牛支原體的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性、耐藥性分析

王冬經(jīng) 徐業(yè)芬 索朗斯珠 嚴(yán)明帥 趙霞玲 朱 勇 牛家強(qiáng)*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院 西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 林芝 860000；3.西藏農(nóng)牧科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850000)

牦牛(Yak)是一個(gè)古老的物種，因其能夠適應(yīng)高海拔、低含氧量、低氣壓、晝夜溫差大和牧草匱乏等其他牛種難以適應(yīng)的高寒草地生態(tài)環(huán)境而得以延續(xù)至今，是我國(guó)高原地區(qū)珍貴的優(yōu)勢(shì)畜種資源，也是一個(gè)寶貴的遺傳基因庫[1]。牦牛可提供肉、乳、毛等畜產(chǎn)品，也可使役，其糞便是當(dāng)?shù)刂匾娜剂蟻碓?，是青藏高原地區(qū)不可或缺的重要畜種[2]。我國(guó)約有牦牛1 500余萬頭，主要分布于青海、西藏、甘肅、四川、云南和新疆，其中西藏牦牛約占全國(guó)總數(shù)的三分之一[3]，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位。特殊的高原環(huán)境容易導(dǎo)致牦牛患呼吸道疾病，其中巴氏桿菌(Pasteurellosis)和牛支原體(Mycoplasmabovis)引發(fā)的感染較為多見。

牛支原體是牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)病原之一[4]，可引起牛肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎等[5]。早在1961年，Hale等[6]首次從患有乳腺炎病牛乳汁中分離到了該病原體。黎濟(jì)申等[7]1983年首次從乳房炎病牛乳汁中分離到了牛支原體。石磊等[8]2008年首次報(bào)道了湖北省由牛支原體引起的以肺組織肉變、壞死為主要特征的肉牛呼吸道傳染病，并命名為“傳染性牛支原體肺炎”。自此之后，牛支原體相關(guān)疾病先后在重慶、寧夏等地相繼報(bào)道[9-10]，該病的廣泛傳播與迅速蔓延給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

牛支原體病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有血清學(xué)、病原學(xué)、分子生物學(xué)方法[11]。流行病學(xué)調(diào)查及初步診斷常采用血清學(xué)方法，但進(jìn)一步確診需采用病原分離和分子生物學(xué)的方法。目前，ELISA法是血清學(xué)方法中最常用的方法之一，被廣泛應(yīng)用于牛支原體感染的流行病學(xué)調(diào)查，但不同檢測(cè)試劑盒的特異性和準(zhǔn)確性存在一定差異[11]；病原分離培養(yǎng)法雖然難度較大，周期較長(zhǎng)，但其結(jié)果直觀可靠、簡(jiǎn)明直接，是確診該病最可靠的方法之一[12]。分離中常采用生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定等方法輔助診斷，其中分子生物學(xué)方法可準(zhǔn)確、快速地對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。由于牛支原體與無乳支原體16S rRNA基因高度相似，兩者難以區(qū)分，因此需采用牛支原體高度保守基因進(jìn)行鑒別診斷，目前使用較多的診斷基因主要有uvrC、OPPD/F等[13-14]。

2012年李坤等[15]通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，西藏多地牦牛感染牛支原體，其中以日喀則、昌都、拉薩等地牦牛牛支原體感染最為嚴(yán)重。2017年以來，西藏多地牦牛出現(xiàn)以食欲下降、消瘦、呼吸急促、發(fā)熱、咳嗽為其特征的疫病，經(jīng)抗生素治療，效果不佳，常轉(zhuǎn)化為慢性呼吸道病，疑似牛支原體感染。鑒于此，本團(tuán)隊(duì)于2019年采集西藏部分地區(qū)有呼吸道癥狀的牦牛鼻拭子進(jìn)行牛支原體的分離鑒定，在病原分離純化的基礎(chǔ)上，合成16S rRNA基因引物及uvrC特異性基因引物對(duì)分離株進(jìn)行分子鑒定，并對(duì)牛支原體牦牛分離株生長(zhǎng)特性及體外藥物敏感性進(jìn)行了分析，旨在從病原角度證實(shí)牛支原體在牦牛中的流行，并對(duì)當(dāng)前流行株進(jìn)行初步研究，為今后牦牛牛支原體病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

通過鼻拭子采集具有咳嗽、喘息、呼吸急促、鼻液較多等呼吸道癥狀的西藏牦牛鼻腔粘液145份，分別置于裝有少量PPLO液體培養(yǎng)基(內(nèi)含有青霉素，可抑制雜菌)的離心管中，快速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行病原分離培養(yǎng)或冷藏處理。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑

PPLO broth、PPLO agar、Yeast Extract、Agar(BD公司，美國(guó))；Sodium pyruvate(Sigma公司，中國(guó))；苯酚紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；NaCl、NaOH、冰醋酸、無水乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；馬血清(Hyclone公司，美國(guó))；青霉素鈉(山東聖旺藥業(yè)股份有限公司，中國(guó))；2xTaq PCR MasterMix、Marker DL2 000、核酸染料(天根生化科技有限公司，中國(guó))；MEM(GIBCO公司，美國(guó))；Tris、Agarose M (BBI LIFE SCIENCES公司，中國(guó))；EDTA(SANGON BIOTECH公司，中國(guó))；生化鑒定管、K-B藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司，中國(guó))。PPLO固體培養(yǎng)基和PPLO液體培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[8]方法制備，置于4 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2主要儀器

純水儀(ELIX10)；ABI PCR儀(Power pac)；離心機(jī)(1730R)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9050)；電泳儀(Powerpac)；凝膠成像儀(G:BOX)；微量移液器(Eppendorf)；電子天平(JA2103 N)；酶標(biāo)儀(RT-6100)；pH計(jì)(PHS-3C)均來自西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 病原的分離與純化

病原分離與純化參照師燕霞等[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，具體方法為：向裝有鼻拭子的離心管中分別加入6 mL PPLO液體培養(yǎng)基，充分震蕩混勻后，2 000 r/min離心6 min，取上清液，用0.45 μm濾器過濾得到約5 mL液體，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)液由紅變黃后，按照 1∶10 的比例傳代培養(yǎng)至3～4代后，涂布于PPLO固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d，挑取單個(gè)菌落接種于PPLO液體培養(yǎng)基。如此“固-液”交替進(jìn)行培養(yǎng)物的純化。

1.4 生化鑒定

分別按照各生化鑒定管使用說明書進(jìn)行。

1.5 DNA提取

采用煮沸法提取牛支原體基因組DNA[16]。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)牛支原體uvrC特異性基因引物[17]與16S rRNA基因引物[18]，并由天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成。

1.7 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照白智迪[17]的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行uvrC特異性基因的PCR擴(kuò)增；參照郭亞男等[18]的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)初步鑒定后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 序列分析

采用DNA Star軟件將分離株uvrC特異性基因序列、16S rRNA基因序列分別與不同參考株進(jìn)行比對(duì)，并采用MAGA 7.0軟件分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。參考株信息如表1所示。

1.9 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

隨機(jī)選取3 株牛支原體分離株，按照1∶10的比例接種至PPLO液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 代使之生長(zhǎng)穩(wěn)定，作為待測(cè)液。將待測(cè)液按照1∶10的比例接種，每個(gè)菌株設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，從培養(yǎng)0 h開始，每隔6 h測(cè)定1次OD630及其pH，至126 h結(jié)束。以菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以平均OD630、pH為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.10 藥敏試驗(yàn)

本次選用14種藥敏紙片進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，分別為強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、紅霉素、氟苯尼考、新霉素、鏈霉素、大觀霉素、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和氧氟沙星。藥敏試驗(yàn)操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照說明書及CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[19],菌液接種平板之后，均勻貼上藥敏紙片。直徑為150 mm的平板貼12張藥敏紙片，直徑90 mm的平板貼6 張藥敏紙片。置于37 ℃培養(yǎng)7 d，測(cè)定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離與菌落形態(tài)觀察

145份鼻腔粘液樣品中，10份得到了純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物經(jīng)PPLO固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在低倍鏡下觀察到“煎蛋狀”菌落形態(tài)(圖1)，初步確定為牛支原體，并分別命名為Tibet-1、Tibet-2、Tibet-3、Tibet-4、Tibet-5、Tibet-6、Tibet-7、Tibet-8、Tibet-9和Tibet-10。

2.2 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示：10株分離株均不發(fā)酵葡萄糖和乳糖，不水解明膠和精氨酸，不分解尿素和甘露醇，且膽固醇試驗(yàn)為陽性。

2.3 PCR檢測(cè)

以10株分離株的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。結(jié)果表明，uvrC特異性基因引物和16S rRNA引物經(jīng)PCR擴(kuò)增分別得到238 bp(圖2(a))和1 500 bp(圖2(b))的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

表1 uvrC特異性基因和16S rRNA基因序列參考株信息表Table 1 Information on reference strains of uvrC specific and 16S rRNA gene sequences

圖1 分離株菌落形態(tài)(40X)Fig.1 Colony morphology of Mycoplasma bovisisolates (40X)

2.4 序列分析

2.4.1同源性分析

uvrC同源性分析結(jié)果顯示，10株西藏牦牛牛支原體分離株之間同源性為98.9%～100%；與我國(guó)牛支原體地方株同源性為98.4%～100%；與日本株同源性為98.4%～100%；與瑞士株同源性為98.4%～100%；與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45的同源性為98.4%～100%；與無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2(Maga PG2)的同源性為76.6%～80.7%；與絲狀支原體絲狀亞種SC型PG1標(biāo)準(zhǔn)株(MmmSC PG1)的同源性為56.3%～57.2%。

M：DNA標(biāo)記DL2 000；N：陰性對(duì)照；1～10依次分別為分離株1～10的擴(kuò)增產(chǎn)物M: Marker; N： negative control; 1-10 is the amplification products of the isolates 1-10 in turn圖2 牛支原體分離株uvrC特異性基因(a)和16S rRNA基因(b)PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of uvrC specific gene and 16S rRNA from Mycoplasma bovis isolates

16S rRNA基因同源性分析結(jié)果顯示，10株西藏牦牛牛支原體分離株之間序列同源性為 99.4%～100%；與我國(guó)牛支原體地方株的同源性為99.1%～100%；與日本株同源性為99.2%～100%；與匈牙利株的同源性為99.1%～100%；與瑞士株同源性為99.2%～100%；與PG45株同源性為99.1%～99.9%；與PG2株的同源性為 98.2%～98.7%；與PG1、PG3、G5的同源性為80.1%～80.7%。

2.4.2基因進(jìn)化樹分析

牦牛牛支原體uvrC進(jìn)化樹顯示，10株西藏牦牛牛支原體分離株uvrC序列相似度較高，且與牛支原體我國(guó)地方株、牛支原體日本株、牛支原體瑞士株、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45處于同一分支，而與無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2和絲狀支原體絲狀亞種SC型標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1處于不同分支(圖3(a))。牦牛牛支原體16S rRNA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，分離株與牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45處于同一分支，親緣關(guān)系較近，但與無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2處于不同分支，因此證明上述分離株屬于牛支原體。10株牛支原體分離株與13株牛支原體參考株的分布在進(jìn)化樹上聚集為 3大簇：牛支原體分離株Tibet-1、Tibet-2、Tibet-6、Tibet-9和參比株08M、16M、CQ-W70、Ningxia-1、FJ-HJ、HB0801株聚為一簇。其中，Tibet-1和Tibet-9與FJ-HJ親緣關(guān)系最近、Tibet-2與08M親緣關(guān)系最近、Tibet-6與16M親緣關(guān)系最近；牛支原體分離株Tibet-3、Tibet-4、Tibet-5、Tibet-10和參比株Hubei-1、JF4278、KG4397聚為一簇。其中，Tibet-3、Tibet-4、Tibet-5與Hubei-1親緣關(guān)系最近、Tibet-10與JF4278親緣關(guān)系最近；牛支原體分離株Tibet-7、Tibet-8和牛支原體參比株NM2012、MYC2、MYC22聚為一簇。其中，Tibet-7與NM2012親緣關(guān)系最近、Tibet-8與MYC22親緣關(guān)系最近(圖3(b))。

本試驗(yàn)從145份樣品中得到的10份純培養(yǎng)物，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、生化鑒定、PCR鑒定及序列分析，證實(shí)其均為牛支原體，其分離率為6.90%(10/145)。

圖3 uvrC特異性基因(a)和16S rRNA基因(b)基因進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of amplification of uvrC specific gene (a) and 16S rRNA gene (b)

2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，10株分離物的OD630及平均pH變化趨勢(shì)一致，這里僅列出3株分離物的結(jié)果。根據(jù)3株西藏牦牛牛支原體分離株在PPLO液體培養(yǎng)基中不同時(shí)間點(diǎn)的平均OD630及平均pH分別繪制生長(zhǎng)曲線如圖4(a)、圖4(b)所示。分離株在PPLO培養(yǎng)基中生長(zhǎng)126 h，其中，培養(yǎng)24 h內(nèi)為遲緩期，培養(yǎng)42 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，78 h后開始進(jìn)入衰亡期；3個(gè)分離株培養(yǎng)物的平均pH隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)pH不斷降低，其中24～42 h期間pH下降最快，隨后下降速度減慢，至78 h后幾乎不再變化。

圖4 牛支原體分離株不同時(shí)間點(diǎn)OD630(a)和pH(b)變化Fig.4 OD630 (a) and pH (b) of Mycoplasma bovis isolates at different time points

2.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，所有分離株均對(duì)一種或多種藥物產(chǎn)生了耐藥，40%的分離株對(duì)林可霉素耐藥；30%的分離株對(duì)阿奇霉素、環(huán)丙沙星耐藥；20%的分離株對(duì)紅霉素、氟苯尼考、大觀霉素、氧氟沙星耐藥；10%的分離株對(duì)四環(huán)素、新霉素、鏈霉素、慶大霉素、恩諾沙星耐藥，但10株牛支原體對(duì)強(qiáng)力霉素、卡那霉素均表現(xiàn)為敏感或中度敏感。

表2 牛支原體分離株耐藥性檢測(cè)Table 2 Antimicrobial susceptibility test of Mycoplasma bovis isolates

3 討 論

牛支原體被公認(rèn)為影響全球養(yǎng)牛業(yè)的一種重要病原體，目前已遍布英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、瑞士、澳大利亞、丹麥、墨西哥、西班牙、以色列以及北美各國(guó)[20]。近十年來，全球相關(guān)研究者對(duì)此病原體進(jìn)行了大量研究，到目前為止還沒有有效的商業(yè)化疫苗來預(yù)防牛支原體病[21]，也沒有徹底治療此病的特效藥物。臨床常用抗生素雖有一定療效，但隨著使用次數(shù)和頻率的增加，病原對(duì)藥物的敏感性就會(huì)降低甚至產(chǎn)生耐藥，帶菌牛常常成為主要傳染來源，這也是造成牛支原體感染率升高的重要原因。因此，進(jìn)行牛支原體流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于該病的監(jiān)測(cè)和防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2015年，李坤等[15,22]報(bào)道了2012和2013年間西藏牦牛牛支原體的感染狀況，其感染率分別為44.32%和47.44%，但未進(jìn)行病原的分離鑒定。2017年，本團(tuán)隊(duì)成員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，西藏牦牛牛支原體感染率高達(dá)46.10%[23]。據(jù)資料顯示，目前我國(guó)西藏、青海、甘肅和四川牦牛群中均存在牛支原體的感染[24]，且在西藏林芝地區(qū)牦牛、黃牛和犏牛感染率均較高[25]。本研究在前期血清學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，采集牛支原體血清抗體檢測(cè)為陽性且具有呼吸急促、咳嗽、食欲不佳和流鼻腔粘液等癥狀的病牛鼻腔粘液進(jìn)行病原分離鑒定，并成功分離到10株牛支原體。同時(shí)，本研究也證實(shí)了病牛可通過鼻腔粘液排出病原體，這將對(duì)同群牛和環(huán)境造成污染，在西藏牦牛、黃牛混養(yǎng)、散養(yǎng)、半圈養(yǎng)模式下，則更容易造成病原在牛群環(huán)境中的擴(kuò)散和漫延。因此，養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意該病的監(jiān)測(cè)，及時(shí)淘汰病牛，不引進(jìn)陽性牛，盡量避免合群混養(yǎng)，定期進(jìn)行環(huán)境消毒等。

牛支原體無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，其基因組僅為106bp左右，缺少大多數(shù)代謝所需的酶，不發(fā)酵葡萄糖和乳糖，不能水解明膠和精氨酸，也不能分解尿素和甘露醇，因此體外培養(yǎng)難度大，需在培養(yǎng)基中加入馬血清、丙酮酸鈉、MEM等物質(zhì)以滿足其對(duì)碳源和含氮化合物的營(yíng)養(yǎng)需求，同時(shí)需向培養(yǎng)箱中通入5% CO2。本試驗(yàn)從145份樣品中分離到牛支原體10株，分離率僅為6.90%，一方面可能由于此次樣品采集的時(shí)間為春季，而非秋末冬初或冬末春初呼吸道病多發(fā)期；另一方面是由于牛支原體對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，體外培養(yǎng)周期長(zhǎng)、難度大；此外，牛支原體常與多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌等混合感染，抗生素往往不能完全抑制雜菌的生長(zhǎng)，分離中容易造成污染，降低分離率。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者圍繞牛支原體膜蛋白、亞單位疫苗和滅活苗等進(jìn)行了大量研究，但由于不同菌株在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、膜蛋白結(jié)構(gòu)組學(xué)上的差異，其免疫效果不容樂觀。因此，具有強(qiáng)感染力和低毒力菌株的篩選，對(duì)研制確實(shí)安全有效的牛支原體疫苗極其迫切且意義重大，而牛支原體的分離鑒定是篩選優(yōu)勢(shì)菌株及牛支原體疫苗研究的前提和基礎(chǔ)。分離株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期等測(cè)定，對(duì)今后開展病原分離培養(yǎng)、最佳傳代時(shí)間選擇、核酸提取及疫苗相關(guān)研究具有基礎(chǔ)性作用。由于目前世界上仍沒有用于預(yù)防牛支原體病的高效、穩(wěn)定、商業(yè)化疫苗，抗生素的大量使用依然是目前控制牛支原體病的重要手段。然而，由于濫用抗生素導(dǎo)致的牛支原體耐藥性的產(chǎn)生，已成為困擾養(yǎng)牛業(yè)的一大難題，正在逐步引起國(guó)內(nèi)外相關(guān)人士的重視[26]。本次所有牛支原體分離株均存在不同程度的耐藥性，不同分離株對(duì)同一類藥物的具體藥物存在不同的敏感性，這可能與當(dāng)?shù)赜盟幏N類和頻率有關(guān)。本研究為臨床防控提供參考，為今后開展牛支原體致病機(jī)理、疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。臨床中推薦選用強(qiáng)力霉素、卡那霉素進(jìn)行治療。本研究對(duì)西藏牦牛牛支原體病的治療具有一定指導(dǎo)意義，臨床中應(yīng)制定合理的用藥交替方案，同時(shí)采取綜合性防控措施，避免對(duì)抗生素的過度依賴或大劑量使用。

4 結(jié) 論

本研究自采集的145份西藏牦牛鼻腔粘液樣本中成功分離并鑒定了10株牛支原體，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h內(nèi)為遲緩期，42 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期，78 h 后開始進(jìn)入衰亡期；體外藥物敏感性試驗(yàn)顯示，所有分離株均對(duì)一種或多種藥物產(chǎn)生了耐藥，但10株牛支原體對(duì)強(qiáng)力霉素、卡那霉素均表現(xiàn)為敏感或中度耐藥，為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥和防控提供依據(jù)。