阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成的瘤胃微生物環(huán)境對(duì)感染致病性大腸桿菌犢牛免疫力的影響

賈知鋒 王純潔* 敖日格樂 賀美玲 張 欣 徐 進(jìn) 呂文亭 付 鶴 任書男 田艷萍 劉佳樂

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

在現(xiàn)代養(yǎng)牛業(yè)中，多種病原菌可導(dǎo)致犢牛腹瀉病的發(fā)生，其中致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichiacoli)占比重較大[1]。大腸桿菌性動(dòng)物腹瀉主要是由腸道炎癥引起，常導(dǎo)致犢牛生長(zhǎng)發(fā)育停歇、免疫力低下、發(fā)病率和死亡率較高[2]。研究者發(fā)現(xiàn)腹瀉多發(fā)生于幼齡動(dòng)物均與瘤胃菌群紊亂有關(guān)[3]。瘤胃菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門和變形菌門等優(yōu)勢(shì)菌群形成生物學(xué)屏障，起到保護(hù)作用[4]。早期瘤胃菌群的形成是在各方面因素(如環(huán)境、母乳和益生菌等)的影響下，才使得犢牛瘤胃提前建立起適應(yīng)外界環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)[5]。目前臨床治療致病性大腸桿菌病首選抗生素，長(zhǎng)期使用抗生素顯著影響胃腸道菌群多樣性，降低藥物療效，出現(xiàn)耐藥性和藥物殘留等問題[6]。因此，研究者開始尋求天然綠色新產(chǎn)品，望其減少抗生素使用。

植物性藥物在進(jìn)入胃腸道后，促進(jìn)胃腸道內(nèi)有益菌的定植，從而形成一道天然屏障來抵御外來病原菌的入侵[7]。草藥復(fù)方具有調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)和緩解腸道炎癥的作用，有望替代抗生素治療大腸桿菌性動(dòng)物腹瀉[8]。作為蒙醫(yī)藥學(xué)重要部分的蒙藥，以其純天然來源和保肝、保腎、抗菌、消炎、滋補(bǔ)、低殘留、低毒副作用和耐藥性小的作用特點(diǎn)，在當(dāng)今依然發(fā)揮著不可替代的作用[9]。阿茹拉-7味散(又稱為古方巴特爾-7)屬于經(jīng)典驗(yàn)方，被《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊(cè))》收錄，根據(jù)其藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方具有清瘟解毒、鎮(zhèn)痛、止痢和提高免疫力等功效[10]，因在治療人類腹瀉[9]、消化性潰瘍[10]和銀霄病[11]等方面有很好的療效，被廣泛應(yīng)用。然而，阿茹拉-7味散能否提前建立瘤胃菌群環(huán)境來抵御致病性E.coli的入侵，并且與抗炎、免疫形成互作尚未有相關(guān)研究。因此，本研究選擇30頭1日齡健康荷斯坦?fàn)倥樵囼?yàn)動(dòng)物，建立阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成瘤胃微生物環(huán)境的動(dòng)物模型，在牛奶中添加不同劑量的阿茹拉-7味散，通過16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)犢牛瘤胃微生物多樣性以及菌落結(jié)構(gòu)組成和豐度進(jìn)行分析；通過RT-PCR法檢測(cè)瘤胃中大腸桿菌的含量；通過ELISA法檢查血清中IL-6、TNF-α、IL-4、IL-2和IFN-γ的含量，探討阿茹拉-7味散在早期建立犢牛瘤胃共生益生微生物組和免疫力形成互動(dòng)的作用機(jī)制，為阿茹拉-7味散生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選擇30頭體重相近(30±2 kg)的1日齡健康荷斯坦?fàn)倥＃徸陨轿骱訛┠膛ＳN有限公司。

1.1.2試驗(yàn)材料

牛源致病菌EscherichiacoliO1保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牛生產(chǎn)學(xué)實(shí)驗(yàn)室[12]；鹽酸環(huán)丙沙星購自成都新亨藥業(yè)有限公司；阿茹拉-7味散由訶子、茜草、甘松、翻白草、瞿麥、乳香和草烏葉組成，購自內(nèi)蒙古呼和浩特市天力藥業(yè)有限公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMIX，購自美國KAPA生物公司；瓊脂糖，購自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑公司；DNA Template Prep Kit 1.0，購自美國太平洋生物學(xué)公司；Agilent DNA 12000 Reagents，購自美國安捷倫科技有限公司；DNA Sequencing Bundle 4.0，購自太平洋生物科學(xué)公司；ELISA試劑盒購自內(nèi)蒙古呼和浩特市寶信生物公司。

1.1.3試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(Synergy HT，上海迭戈生物科技有限公司)；PCR儀(Biosafer公司，德國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1阿茹拉-7味散的制備

將訶子、茜草、甘松、翻白草、瞿麥、乳香和草烏葉粉碎，過200目篩，再按照3∶2∶2∶2∶1∶2∶2的比例配伍用藥[9]。

1.2.2試驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及給藥方案

荷斯坦?fàn)倥?shí)驗(yàn)方案均已獲得內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牲畜護(hù)理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并按照內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。1周齡犢牛每日4 L牛奶，分別將試驗(yàn)藥品混于牛奶中，并于6:30和18:30分別進(jìn)行人工飼喂。犢牛飼養(yǎng)管理參見文獻(xiàn)[13]。

選擇30頭體重相近1日齡的健康荷斯坦?fàn)倥＃S機(jī)分成6組，每組5頭牛見表1。將各試驗(yàn)藥物混于牛奶中給藥，先給藥4 d，2 次/d，于第5 d早上口服E.coliO1(2.50 × 1011CFU/mL, 100 mL/頭)1 h 后再繼續(xù)給藥，未治療組(Untreated control，UC)、環(huán)丙沙星組(Ciprofloxacin，CIP)、阿茹拉低劑量組(Low dose of Baatar seven powder，BSP.L)、阿茹拉中劑量組(Medium dose of Baatar seven powder，BSP.M)和阿茹拉高劑量組(High dose of Baatar seven powder，BSP.H)組犢牛經(jīng)口服接種致病性E.coliO1建立腹瀉模型，對(duì)照組(Normal control，NC)犢?？诜o菌生理鹽水，其它給藥組再繼續(xù)給藥至第7 d，2 次/d。于第7 d末次給藥1 h后將犢牛在標(biāo)準(zhǔn)化屠宰場(chǎng)放血致死，同時(shí)，用采血管頸靜脈采集血液，分離血清，用棉簽采集瘤胃內(nèi)容物裝入凍存管放于液氮保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及給藥方案Table 1 Establishment of experimental animal model and administration plan

1.2.3犢牛血清細(xì)胞因子的檢測(cè)

第7 d末次給藥1 h后，通過頸靜脈采集犢牛血液，靜止1 h后，離心(在4 ℃下3 000 g離心15 min)分離血清，并保存于-20 ℃冰箱。使用ELISA試劑盒測(cè)量IL-6、TNF-α、IL-4、IL-2和 IFN-γ 的含量[14]。

1.2.4細(xì)菌DNA的提取和16S rRNA基因序列擴(kuò)增

給藥7 d后，將犢牛放血致死，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini-Kit試劑盒(根據(jù)說明書操作)對(duì)犢牛瘤胃內(nèi)容物提取細(xì)菌DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)細(xì)菌DNA純度(OD260/OD280=1.8～2.0)和質(zhì)量濃度(100 μg/μL)，將合格的DNA置于-80 ℃保存。利用PCR對(duì)每份樣品的DNA進(jìn)行16S rRNA基因V3+V4區(qū)擴(kuò)增，使用Thermofisher的IonS5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序(測(cè)序模式為SE600)。正向通用引物為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，反向通用引物為805R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。這對(duì)引物被用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)序列，PCR擴(kuò)增反應(yīng)50 μL體系參考[15]：包括10 ng/μL(5 μL)模板DNA、5 μL Taq聚合酶(5 U/μL；TaKaRa，Japan)以及上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。使用GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific 公司)回收PCR純化產(chǎn)物。最后將純化產(chǎn)物送往北京諾禾致源科技股份有限公司上機(jī)測(cè)序。利用Qiime軟件(Version 1.9.1)分析Alpha多樣性[16]。

大腸桿菌檢測(cè)：將腹瀉犢牛瘤胃內(nèi)容物合格的DNA用熒光定量PCR法檢測(cè)大腸桿菌O1:K88(引物設(shè)計(jì)：F:5′-AAGGGAAATGTGGTGAAA-3′；R:5′- CGGTTTCTTCTTGTTAATCG-3′)的含量。反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL的PCR Master Mix，上下游引物各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，7.5 μL ddH2O，PCR程序設(shè)置：預(yù)變性(92 ℃，45 s)，變性(92 ℃，30 s)，退火(60 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，1 min)，共40個(gè)循環(huán)，終端延伸(72 ℃，45 s)，終止(4 ℃)[8]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 犢牛瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌菌落Alpha多樣性分析

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、辛普森指數(shù)(Simpson index)、Chao1指數(shù)和ACE豐富度指數(shù)是用于評(píng)估物種的多樣性和豐富度見表2。給藥 7 d 后，與NC組相比，UC組中Shannon 指數(shù),(P=0.114)、(Simpson 指數(shù)(P=0.768)和Chao1指數(shù)(P=0.053)無顯著差異，但ACE指數(shù)在UC組中顯著降低(P=0.013)；與UC組相比，BSP.M組中Chao1指數(shù)(P=0.001)、Shannon指數(shù)(P=0.023)和ACE指數(shù)(P=0.000 1)顯著升高；BSP.L組中Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和ACE指數(shù)較UC組顯著降低(均為P=0.000 1)，BSP.H組中多樣性指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)；說明BSP.M組的犢牛瘤胃微生物菌群多樣性和豐富度較高。結(jié)果表明，BSP.M組樣品表現(xiàn)出較高水平的細(xì)菌生物多樣性。

表2 不同劑量的阿茹拉-7味散對(duì)犢牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響Table 2 Effects of different doses of Baatar-7 powder on calf rumen microbial Alpha diversity

2.2 阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成的瘤胃微生物對(duì)感染致病性大腸桿菌犢牛細(xì)菌門、屬水平菌群豐度的影響

給藥7 d后，為尋找6組之間優(yōu)勢(shì)物種的差異，通過Version 3.8.31比對(duì)發(fā)現(xiàn)，6組樣本在門和屬水平上平均豐度(存在顯著差異)排名前10的物種見表3。在門水平，與NC組相比，UC組中梭桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌屬的豐度均極顯著升高(P<0.05)；在屬水平，UC組中擬桿菌屬(P=0.975)、柔嫩梭菌屬(P=0.926)和毛螺菌球菌屬(P=0.234)的豐度較NC組均無顯著變化。

與UC組相比，BSP.L、BSP.M和BSP.H組中梭桿菌門和變形菌門的豐度極顯著降低(P<0.05)，并且BSP.L和BSP.H組中放線菌門的豐度極顯著降低(P=0.000 1)；BSP.L組中柔嫩梭菌屬顯著升高(P=0.045)，BSP.L(P=0.001)和 BSP.M 組(P=0.001)中毛螺菌球菌屬的豐度顯著升高(P<0.05)。

表3 不同劑量的阿茹拉-7味散對(duì)犢牛瘤胃微生物豐度的影響Table 3 Effects of different doses of Baatar-7 powder on the rumen microbial structure of calves %

2.3 阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成的瘤胃微生物對(duì)感染致病性大腸桿菌犢牛瘤胃中大腸桿菌含量的影響

通過RT-PCR定量分析犢牛瘤胃中大腸桿菌的含量見表4。給藥7 d后，與NC組相比，UC組中大腸桿菌的含量顯著升高(P=0.000 1)；與UC組相比，BSP.L(P=0.004)、BSP.M(P=0.002)和BSP.H組(P=0.001)中大腸桿菌的含量顯著下降(P<0.05)；與CIP組相比，BSP.M(P=0.070)和BSP.H組(P=0.101)中大腸桿菌的含量無顯著差異，說明BSP.M和BSP.H組可降低大腸桿菌的水平，并與CIP相當(dāng)。

表4 不同劑量的阿茹拉-7味散對(duì)犢牛瘤胃中大腸桿菌含量的影響Table 4 Effects of different doses of Baatar-7 powder on the content ofE.coli in the rumen of calves lgCFU/g

2.4 阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成的瘤胃微生物對(duì)感染致病性大腸桿菌犢牛腹瀉率、體重以及平均日增重的影響

阿茹拉-7味散對(duì)腹瀉犢牛腹瀉率的影響見圖1(a)。給藥7 d后，NC組無腹瀉；UC組犢牛腹瀉率達(dá)80%；各用藥組使?fàn)倥８篂a率急劇下降；BSP.M和BSP.H組犢牛腹瀉率與CIP相同，下降到20%，說明BSP可降低犢牛感染致病性E.coli引起腹瀉發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

阿茹拉-7味散早期干預(yù)形成的瘤胃微生物對(duì)大腸桿菌性犢牛體重增加的影響見圖1(b)，給藥第0 d，各試驗(yàn)組之間新生犢牛體重差異不顯著(P>0.05)；給藥7 d后，與NC組相比，UC組犢牛體重(P=0.021，圖1(c))和日增重(P=0.002，圖1(d))顯著降低(P<0.05)；與UC組相比，BSP.M和BSP.H組犢牛體重和日增重顯著升高(均為P=0.001，P<0.05)，說明飼喂BSP.M和BSP.H可維持腹瀉犢牛體重，有利于日增重增加。

在相同的直方圖中，具有相同小字母上標(biāo)的值均無顯著性差異(P>0.05)，而具有不同小寫字母上標(biāo)的值均具有顯著性差異(P<0.05)。The values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).圖1 不同組別的犢牛腹瀉率、體重以及平均日增重Fig.1 The effect of different groups on diarrhea rate，weight gain and average daily gain of diarrhea calves

2.5 阿茹拉-7味散對(duì)感染致病性E.coli O1犢牛血清中免疫細(xì)胞因子的影響

阿茹拉-7味散對(duì)犢牛血清中抗炎、免疫細(xì)胞因子的影響見表5，給藥7 d后，與NC組相比，UC組血清中IL-4(P=0.007)、IL-2(P=0.000 1)和IFN-γ(P=0.021)的含量顯著下降，但TNF-α(P=0.010)的含量顯著升高；與UC組相比，BSP.M組血清中IL-4的含量顯著升高(P=0.006)，并與NC(P=0.982)和CIP組(P=0.421)持平；BSP.L、BSP.M和BSP.H組血清中IL-2和IFN-γ的含量顯著升高(均P<0.05)；BSP.M和BSP.H組中IL-6和TNF-α的含量顯著降低(均P<0.05)，說明BSP可防止炎癥的發(fā)生，調(diào)節(jié)抗炎、免疫因子的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

3 討 論

已有研究表明致病性大腸桿菌是引起犢牛腹瀉最主要的致病菌[2]。植物性藥物通過調(diào)節(jié)腸道微生物可減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[17]，因此，植物性藥物具有抑菌、殺菌、消炎、提高免疫力和改善胃腸道菌群等多種功能[4]?；谥参镄运幬锸嵌喟悬c(diǎn)、多水平的作用藥物，通過飼料中添加不同劑量的藤黃提取物(藤黃素)對(duì)腹瀉仔豬研究發(fā)現(xiàn)，藤黃素中、高劑量組中Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組，并且中劑量組在調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性方面效果優(yōu)于高劑量組[16]。因此，篩選出最佳劑量的植物性藥物對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)意義。本研究中，與UC組和阿茹拉-7味散高劑量藥物相比， BSP.M組多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和ACE指數(shù))顯著升高，說明阿茹拉-7味散中劑量藥物瘤胃微生物豐富度和多樣性高于UC組和中劑量藥物，本研究與Wang等[16]試驗(yàn)結(jié)果一致。

出生3日齡的犢牛瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌門主要為擬桿菌門，有利于降解非纖維物質(zhì)，而成年反芻動(dòng)物瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌門主要為厚壁菌門，可降解纖維物質(zhì)；隨著犢牛的成長(zhǎng)，犢牛瘤胃中擬桿菌門數(shù)量逐漸減少，厚壁菌門數(shù)量逐漸增加[18]。本研究中，與UC和CIP組相比，BSP.L和BSP.M組犢牛瘤胃內(nèi)厚壁菌門細(xì)菌顯著升高，擬桿菌門顯著降低，這說明飼喂阿茹拉-7味散改變犢牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)可能有利于提前建立適應(yīng)日糧的轉(zhuǎn)化。多數(shù)梭桿菌門內(nèi)的細(xì)菌是條件致病菌，而變形菌門包含大腸桿菌，多數(shù)為致病菌，易造成動(dòng)物機(jī)體損傷，炎癥加重[19]。本研究中，不同劑量的BSP可顯著降低犢牛瘤胃內(nèi)梭桿菌門、變形菌門和大腸桿菌數(shù)量，并與抗生素組相當(dāng)，這說明飼喂阿茹拉-7味散具有抑制致病菌生長(zhǎng)的作用，有望減少抗生素的使用。

表5 不同劑量的阿茹拉-7味散對(duì)犢牛血清免疫細(xì)胞因子的影響Table 5 Effects of Baatar-7 powder on immune cytokines in calves pg/mL

在內(nèi)熱證中厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門的豐度升高，一些清熱證復(fù)方使擬桿菌門的豐度顯著降低[20]。靈芝菌絲體水提物可通過降低變形菌門的豐度保護(hù)腸道損傷，逆轉(zhuǎn)菌群結(jié)構(gòu)紊亂，減少 TNF-α 和IL-6的產(chǎn)生，炎癥減輕[21]，因此可將變形菌門和大腸桿菌作為疾病微生物信號(hào)指標(biāo)。梭桿菌門包含多種致病菌(如產(chǎn)氣莢膜梭菌)，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)動(dòng)物具有很大的毒性，可破壞腸黏膜結(jié)構(gòu)[22]。本研究中，與UC組相比，BSP可顯著增加犢牛血清中IL-2和IFN-γ的含量以及增加瘤胃微生物厚壁菌門的豐度；BSP.M和BSP.H組顯著降低IL-6、TNF-α的含量和顯著降低梭桿菌門和變形菌門的豐度，這說明飼喂BSP可通過增加厚壁菌門的細(xì)菌，抑制梭桿菌門和變形菌門細(xì)菌的生長(zhǎng)有利于預(yù)防炎癥的發(fā)生。

舒迎霜等[19]發(fā)現(xiàn)黃芪總皂苷使結(jié)腸炎模型動(dòng)物腸道中柔嫩梭菌屬和毛螺菌球菌屬增加，降低梭桿菌屬和大腸桿菌的含量，降低腸道炎癥，從而起到保護(hù)腸道的作用。Yan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過降低梭桿菌屬的豐度，從而增加了抗炎(如IL-2、IFN-γ和IL-4等)水平。在本研究中，UC隨著BSP.L和BSP.M組犢牛瘤胃內(nèi)毛螺菌球菌屬和柔嫩梭菌屬數(shù)量的升高，梭桿菌屬和大腸桿菌數(shù)量的降低，TNF-α和IL-6的產(chǎn)生減少，從這些結(jié)果推測(cè)阿茹拉-7味散可提前建立有益菌來避免致病菌直接與腸壁接觸，增強(qiáng)了IL-2、IFN-γ和IL-4的表達(dá)，減少炎癥發(fā)生，提高了免疫力，促進(jìn)了體重增加，最終達(dá)到降低腹瀉的目的。

近年來，飼料安全問題備受關(guān)注，純天然、無公害、無抗生素殘留和功能全面的草藥成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素大量、廣泛使用，迅速形成多種抗生素耐藥的大量菌株，降低藥物療效。該方是一種以純天然植物為原料，具有很強(qiáng)的保肝、保腎、抗菌、消炎、滋補(bǔ)、低殘留、低毒副作用、耐藥性小、調(diào)節(jié)胃腸道菌群和提高免疫力的作用特點(diǎn)。本研究表明，阿茹拉-7味散早期干預(yù)建立的瘤胃微生物環(huán)境在一定程度上可使感染致病性E.coliO1犢牛瘤胃內(nèi)菌群數(shù)量增多，多樣性升高，且阿茹拉-7味散可使瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，益生菌所占比例增加，條件致病菌水平下降，提高其抗炎、免疫機(jī)能，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能，從而降低腹瀉發(fā)生率。本研究為進(jìn)一步開發(fā)利用植物性藥物來改善感染大腸桿菌犢牛腹瀉，提高機(jī)體抗炎、免疫和胃腸道菌群的功能提供了基礎(chǔ)，并為植物性藥物的生物學(xué)效應(yīng)及其作為功能性飼料添加劑的潛力提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。