敲低STOML2基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC3增殖和遷移以及線粒體膜電位的影響

李立坤，張小軍，么安亮，王 勇，劉 健，胡錦洋，程代川，曹鳳宏

0 引 言

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常見惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)2019年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，美國(guó)PCa發(fā)病率位居男性腫瘤之首，死亡率位于男性惡性腫瘤第二，僅次于肺癌[2]。近年來，我國(guó)PCa發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，且增長(zhǎng)速度比歐美國(guó)家更為迅速[3]。PCa的發(fā)生與基因、遺傳、年齡、種族等多種因素密切相關(guān)[4]。前期課題組對(duì)Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于PCa基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的文獻(xiàn)進(jìn)行了深入的信息學(xué)分析[5]，發(fā)現(xiàn)STOML2基因被多個(gè)研究小組獨(dú)立發(fā)現(xiàn)[6-7]，目前發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌、甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中STOML2高表達(dá)[8-13]，干預(yù)STOML2表達(dá)可以影響腫瘤的生物學(xué)特性，提示STOML2基因改變可能是多種腫瘤發(fā)生的共同途徑。我們課題組對(duì)臨床PCa組織標(biāo)本的研究表明[14]，PCa組織中STOML2蛋白的表達(dá)水平明顯高于前列腺增生組織，并發(fā)現(xiàn)PCa遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與STOML2蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。提示STOML2可能在PCa發(fā)病中起重要作用。本研究旨在探究敲低STOML2基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞增殖、體外遷移及細(xì)胞線粒體膜電位等腫瘤生物學(xué)功能的影響，并初步探索其機(jī)制，以期豐富PCa發(fā)病機(jī)制，為提PCa治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco)，青霉素、鏈霉素(石藥集團(tuán))，STOML2基因引物(北京金唯智科技有限公司)，質(zhì)粒載體Pll3.7-EGFP、包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G(中日友好醫(yī)院臨床研究所贈(zèng)予)，STOML2抗體(Abcam公司)，鼠抗人β-actin抗體和IgG抗體(南京三箭)，MTT(四唑鹽)試劑(美國(guó)Thermo公司)，TMRE試劑盒(Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，超微量分光光度計(jì)Q5000(Quawell)，流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD公司)，蛋白垂直電泳儀Mini-proteinIII(美國(guó)Bio-Rad公司)，成像儀ChemiDocTMXRS+(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌PC3細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。PC3細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%密度時(shí)，按照1∶3比例進(jìn)行消化并傳代。

1.3慢病毒載體構(gòu)建及鑒定構(gòu)建Pll3.7-EGFP質(zhì)粒并帶有U6啟動(dòng)子的敲低組(LV-SHSTOML2)和隨機(jī)序列對(duì)照組(LV-SHCON)重組質(zhì)粒(中日友好醫(yī)院贈(zèng)予)，NCBI中查詢STOML2的基因序列及mRNA，根據(jù)shDNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。其干擾敲低靶點(diǎn)序列：STOML2 shDNA：上游引物：5'-TCCGTTATGAGATCAAGGATATCCTTCAAGAGAGGATATCCTTGATCTCATAACGGTTTTTTC-3'；下游引物：5'-GAAAAACCGTTATGAGATCAAGGATATCCTCTCTTGAAGGATATCCTTGATCTCATAACGGA-3'。隨機(jī)序列：STOML2 shDNA-Con：上游引物:5′-TGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGAGAGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTC-3′;下游引物：5′-GAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCTCTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCA-3′。

1.4質(zhì)粒提取和慢病毒包裝將shDNA-STOML2及SHCON序列重組入PLL3.7。將前述攜帶敲低STOML2序列和隨機(jī)序列的重組質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒用堿裂解法大量抽提，PEG8000-Mgcl2法純化質(zhì)粒，超微量分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度，以A260/280以1.88～1.92為最佳，重復(fù)3次取均值。選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HEK293T細(xì)胞，將目的質(zhì)粒、psPAX2和pMD2.G包裝質(zhì)粒按照4∶2∶1比例進(jìn)行病毒包裝，48 h后離心收集上清并測(cè)量病毒滴度。

1.5PC3細(xì)胞感染及分組胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3細(xì)胞，按4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度為30%～40%時(shí)，分別加入shDNA-STOML2及SHCON的病毒進(jìn)行感染，24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光量80%～90%后，胰酶消化以0.5～1個(gè)細(xì)胞密度接種至96孔板，每5～7天換液1次，小孔內(nèi)長(zhǎng)滿接種于24孔板，長(zhǎng)滿以后再接種于6孔板。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況以評(píng)定轉(zhuǎn)染效率。提取熒光量接近100%細(xì)胞組蛋白，用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)STOML2蛋白表達(dá)量，以未轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC3為空白對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列為陰性對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染shDNA-STOML2慢病毒載體為敲低組。

1.6MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC3細(xì)胞的增殖能力為了觀察STOML2基因?qū)?xì)胞增殖的影響，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組前列腺癌PC3細(xì)胞接種在96孔板(4×103個(gè)/孔)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h后，加入MTT溶液后孵育4 h，吸去MTT培養(yǎng)基混合液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定A值(490 nm、單波長(zhǎng))。

1.7細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC3細(xì)胞的體外遷移能力選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組前列腺癌PC3細(xì)胞接種在6孔板中，每組做3個(gè)復(fù)孔，待各組細(xì)胞貼壁后密度達(dá)80%左右時(shí)，無菌槍頭垂直于底部做直線劃痕。于0、24、48 h培養(yǎng)結(jié)束后，選擇相同位置拍照取樣。用Image J處理圖像，計(jì)算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。劃痕愈合率公式計(jì)算如下：

劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-t h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC3細(xì)胞線粒體膜電位水平收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組前列腺癌PC3細(xì)胞，0.25%胰酶消化加入完全培養(yǎng)基終止消化，以1000 r/min(離心半徑15 cm)離心5 min收集細(xì)胞，PBS沖洗2次，保證洗去血清。加入0.5 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后加入TMRE，終濃度為100 nmol/L，放入37 ℃孵育30 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè)。

1.9Western blot檢測(cè)前列腺癌PC3細(xì)胞中STOML2、p-erk、Erk和p-akt、Akt蛋白的表達(dá)收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組前列腺癌PC3細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞總蛋白提取，每孔上樣15 μg，10% SDS-PAGE 15V電泳30 min，硝酸纖維素膜15 V半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜20 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，之后將條帶放入anti-STOML2(1∶500)、p-erk(1∶500)、Erk(1∶500)、p-akt(1∶500)、Akt(1∶500)和β-actin(1∶3000),4 ℃孵育過夜；次日TBST洗滌3次后二抗孵育2 h，成像儀獲取化學(xué)自發(fā)光顯影，Image J軟件進(jìn)行計(jì)算分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1敲低STOML2基因在人前列腺癌PC3細(xì)胞株的建立和鑒定對(duì)連結(jié)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，敲低及隨機(jī)序列對(duì)照組質(zhì)粒的插入序列與設(shè)計(jì)100%吻合，見圖1。質(zhì)粒載體PLL3.7-EGFP攜帶有綠色熒光編碼序列，可反映轉(zhuǎn)染效率，可見轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組和敲低組中綠色熒光布滿視野，綠色熒光量均接近100%，模型構(gòu)建成功，見圖2。

a：敲低組； b：陰性對(duì)照組

圖 2 質(zhì)粒載體PLL3.7-EGFP在各組PC3細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率( ×200)

2.2敲低STOML2基因組STOML2蛋白的表達(dá)敲低組STOML2/β-actin相對(duì)表達(dá)水平較陰性對(duì)照組明顯較少(P<0.01)，提示模型構(gòu)建成功。見圖3。

1:空白對(duì)照組； 2：陰性對(duì)照組； 3：敲低組

2.3敲低STOML2基因?qū)θ饲傲邢侔㏄C3細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)MTT法檢測(cè)結(jié)果：敲低組24、48、72 h時(shí)A值高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表 1 MTT法檢測(cè)感染慢病毒后PC3細(xì)胞增殖能力的影響

2.4敲低STOML2基因后人前列腺癌PC3細(xì)胞體外遷移能力降低體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與陰性對(duì)照組細(xì)胞比較，24h和48h后敲低組細(xì)胞的遷移率顯著下降(P<0.05)。結(jié)果提示，敲低STOML2基因后抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的體外遷移能力。見圖4、圖5。

圖 4 鏡下觀察敲低STOML2后PC3細(xì)胞橫向遷移能力

與陰性對(duì)照組相比，*P<0.01

2.5敲低STOML2基因后人前列腺癌PC3線粒體膜電位的水平升高敲低組細(xì)胞膜電位水平高于轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列陰性對(duì)照組(P<0.01)。見圖6、圖7。提示敲低STOML2基因能夠提高前列腺癌PC3細(xì)胞膜電位水平。

2.6Western blot檢測(cè)各組p-erk、Erk、p-akt和Akt結(jié)果與陰性對(duì)照組細(xì)胞比較，敲低組PC3細(xì)胞中p-erk、Akt蛋白表達(dá)量降低，p-akt蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；而Erk蛋白表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖8。上述結(jié)果提示敲低STOML2基因能夠降低Akt、p-erk，而增高p-akt蛋白表達(dá)量。

圖 6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲低STOML2后PC3細(xì)胞線粒體膜電位

與陰性對(duì)照組相比，*P<0.01

1:空白對(duì)照組； 2：陰性對(duì)照組； 3：敲低組

3 討 論

PCa是發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[15]。PCa是一種進(jìn)展緩慢的癌癥，在疾病早期階段，患者多無明顯癥狀，然而當(dāng)PCa患者就診時(shí)以中晚期為主，并發(fā)生多處轉(zhuǎn)移，患者的生存期也大為縮短[16]，然而現(xiàn)階段尚無完善、有效的治療策略應(yīng)對(duì)晚期PCa患者。因此，迫切需要對(duì)PCa的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以便對(duì)PCa臨床的診療工作提供指導(dǎo)。

前期研究發(fā)現(xiàn)STOML2蛋白在PCa患者和前列腺增生患者中差異表達(dá)且與轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]，提示STOML2基因與腫瘤發(fā)生和遷移密切相關(guān)。選取前列腺癌PC3細(xì)胞系作為研究對(duì)象，PC3細(xì)胞系是從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的，是雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞，分化程度低，惡性程度高，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能，被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究[17]。運(yùn)用慢病毒技術(shù)敲低了PC3細(xì)胞STOML2基因，PC3細(xì)胞出現(xiàn)了增殖加快而遷移降低的現(xiàn)象，提示敲低STOML2基因可能在PCa發(fā)生中是一把雙刃劍，既能促進(jìn)PCa細(xì)胞增殖，又能抑制PCa細(xì)胞的遷移。

STOML2是stomatin超家族成員，定位于9p13.1，編碼的STOML2蛋白由357個(gè)氨基酸殘基組成[18]。研究表明，STOML2主要定位在線粒體內(nèi)膜上[19]，并與心磷脂蛋白及抗增殖蛋白在線粒體內(nèi)膜上形成特化的功能膜微區(qū)，這些區(qū)域?qū)€粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性、調(diào)控線粒體呼吸功能至關(guān)重要[20-21]。腫瘤發(fā)生時(shí)會(huì)發(fā)生瓦博格效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞即使在有氧情況下也減少有氧氧化，通過無氧酵解獲取能量[22-23]。敲低STOML2后線粒體膜電位增高，提示此時(shí)PC3細(xì)胞瓦博格效應(yīng)減弱，細(xì)胞部分恢復(fù)正常代謝，STOML2基因?qū)δ[瘤代謝的影響還需進(jìn)一步研究。

Erk廣泛存于人體組織，參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移和自噬等調(diào)控[24]，Erk激活可抑制腫瘤包括前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[25-27]。前列腺癌PC3細(xì)胞敲低STOML2基因后，Erk蛋白總量沒有改變，但Erk磷酸化水平降低，提示Erk通路活化水平降低。Erk蛋白腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Erk活化后能使金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達(dá)增強(qiáng)[28]，而敲低Erk能使MMP-2和MMP-9表達(dá)降低[29]。提示敲低STOML2基因可以通過下調(diào)Erk通路，抑制PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

PC3細(xì)胞敲低STOML2基因后，Akt表達(dá)雖然降低，但Akt磷酸化水平卻大幅增高，提示此時(shí)Akt途徑增高。Akt在腫瘤細(xì)胞的增殖和存活中有重要作用[30-31]。p-akt通過激活核糖體蛋白S6增加核糖體生物合成，抑制ERBB2基因等癌基因的過表達(dá)，抑制BAD、BCL2等凋亡分子的磷酸化，使細(xì)胞存活和增殖增加[32-33]。提示STOML2基因被敲低后，Akt通路被激活，細(xì)胞增殖加快、存活增加。

綜上，敲低STOML2基因可以使PC3細(xì)胞增殖速度加快，體外遷移能力降低。這些腫瘤生物學(xué)改變可能與PC3細(xì)胞膜電位增加、Akt通路被激活和Erk通路降低有關(guān)。提示STOML2基因在PCa發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起到雙重作用。隨著對(duì)STOML2基因在PCa發(fā)病中作用的深入認(rèn)識(shí)，能為前列腺癌的臨床診療工作提供新的思路。