染料改性膽紅素吸附膜的制備

鞠佳，孔鵬飛，封瑞江，梁飛雪，張曉欣，賀高紅，楊磊

（1 遼寧石油化工大學(xué)石油化工學(xué)院，遼寧撫順113001；2 大連理工大學(xué)化工學(xué)院，精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024）

膽紅素是血紅蛋白的降解產(chǎn)物，當(dāng)肝臟受損或代謝受阻時(shí)，體內(nèi)膽紅素迅速升高，嚴(yán)重時(shí)將對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[1-2]。臨床降黃有很多方法，如藥物治療、手術(shù)治療、介入治療等，但是當(dāng)器官移植的術(shù)前術(shù)后，人體不能進(jìn)行正常地代謝，臨床通常采用血液灌流直接吸附去除高濃度膽紅素。目前血液灌流臨床主要采用聚合物微球或顆粒吸附劑[3-5]裝填成柱，但是因其擴(kuò)散路徑長、阻力大、飽和吸附量較低，在一定程度上存在治療時(shí)間長、吸附效率低、治療費(fèi)用高等問題。許多研究者發(fā)現(xiàn)無機(jī)納米材料例如碳納米管[6]顯示出較一般聚合物材料更高的膽紅素吸附量，但是直接采用粉體形式的無機(jī)納米材料裝填吸附柱存在吸附劑粉體隨血液循環(huán)泄漏的可能，其血液相容性有待提高[7]。

親和膜作為一種可選擇的血液灌流吸附材料，可有效克服粉體或顆粒吸附劑在傳質(zhì)上的限制，減少了泄漏的可能。與顆?；蛘叻垠w材料相比，親和膜具有擴(kuò)散路徑短、阻力小、液體通量較大等特點(diǎn)[8]，因此采用親和膜作為吸附材料可以顯著縮短治療時(shí)間，減少治療時(shí)間長帶來的痛苦。為了進(jìn)一步提高親和膜的傳質(zhì)效率，可以通過共混無機(jī)納米材料制備有機(jī)無機(jī)共混親和膜[9]。另一方面，還可以通過接枝特異性配基增強(qiáng)親和膜的選擇性和特異性[10-14]，實(shí)現(xiàn)膽紅素的高效吸附與分離[15-16]。石巍等[17]以尼龍膜為基膜，將親水性物質(zhì)羥乙基纖維素和殼聚糖共價(jià)鍵合在膜上，再采用多種活化試劑將聚賴氨酸固載在膜上，制備出了用于吸附膽紅素的親和微濾膜。乙酸纖維素/聚乙烯亞胺共混微濾膜（CA/PEI膜）是一種新型的膽紅素吸附膜，不但對(duì)游離膽紅素具有較好的吸附效果，而且具有較好的血液相容性[18]，但是其血清中膽紅素吸附量明顯降低。CA/PEI膜因共混聚乙烯亞胺（PEI）含有較多伯、仲胺基，能夠與許多基團(tuán)在較溫和的條件下發(fā)生反應(yīng)[19-20]，使進(jìn)一步改性接枝配基制備出特異性吸附膽紅素的親和膜成為可能。

配基的選擇對(duì)于提高親和膜的膽紅素吸附量尤為重要[21-22]?；钚匀玖献鳛橛H和膜改性的通用性配基[22-26]，由于具有氯等反應(yīng)基團(tuán)，能夠直接與羥基、氨基、巰基等進(jìn)行反應(yīng)，常被應(yīng)用于材料的親和改性[27]?；钚匀玖掀退{(lán)F3GA（CBA）結(jié)構(gòu)如圖1 所示，含有苯環(huán)和氨基等基團(tuán)，能夠通過靜電、氫鍵、疏水相互作用等吸附膽紅素。有研究顯示接枝CBA 配基能夠提高親和吸附材料在血清或血漿中的膽紅素吸附量[28]。Bayramoglu 等[29]以甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）和甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）為單體制備丙烯酸水凝膠共聚物膜，將PEI接枝到膜表面，再將CBA共價(jià)固定在膜上，用于吸附血清中的膽紅素，改性膜的吸附量提高了13.8倍。

圖1 汽巴藍(lán)F3GA分子式

本論文依據(jù)膽紅素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇了CBA 活性染料作為配基，通過上染、固色、清洗等步驟制備CA/PEI-CBA 膜。首先，利用XPS 和ATR-FTIR 分析了CA/PEI-CBA膜化學(xué)和元素組成，其次通過正交實(shí)驗(yàn)和單邊實(shí)驗(yàn)研究了染料改性膜的制備條件反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、CBA 濃度對(duì)其膽紅素吸附量的影響。由于固色步驟需在高于環(huán)境溫度、強(qiáng)堿性條件下進(jìn)行，這可能對(duì)CA/PEI 膜的多孔結(jié)構(gòu)有一定的影響，因此正交實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了制備條件對(duì)膜失重率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

乙酸纖維素（CA），HB-105，美國Hoechst Celanese 公司；聚乙烯亞胺（PEI），50%水溶液，Mn=60000，伯、仲、叔胺比為1∶2∶1，美國Sigma 公司；多異氰酸酯（主要成分二異氰酸酯MDI），工業(yè)級(jí)，美國羅門哈斯公司；水合茚三酮，天津市大茂化學(xué)試劑廠；膽紅素，Acros Organics，美國；人血白蛋白（HA），20%溶液，西班牙基立福；汽巴藍(lán)F3GA（CBA），美國Sigma公司。

UV-7504 PC 紫外可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；THZ-82（A）恒溫水浴振蕩器，江蘇金壇市科析儀器有限公司；ATREQUINOX55傅里葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER OPTICS 公司；Hitachi-S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Kratos Axis Supra X 射線光電子能譜儀，日本島津公司。

1.2 CA/PEI-CBA膜的制備及表征

CA/PEI 膜的制備：CA/PEI 膜是通過乙酸纖維素與聚乙烯亞胺共混、交聯(lián)、水蒸氣誘導(dǎo)干濕相轉(zhuǎn)化法等步驟制備而成[30]，本文按照CA/PEI 共混質(zhì)量比為13.3，MDI/PEI 的交聯(lián)質(zhì)量比為0.5 的較優(yōu)比例制備CA/PEI膜。

CA/PEI-CBA 膜 的 制 備：CA/PEI-CBA 膜 通 過上染、固色、清洗等主要步驟制備完成。首先配制濃 度 為0.2～10mg/mL 的CBA 水 溶 液20mL，將40mg 的CA/PEI 膜浸入到染料溶液中，加入一定量NaCl 固體，使溶液中NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，在80℃下恒溫0.5h；再加入一定量Na2CO3固體，使溶液中Na2CO3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，在30～80℃溫度下恒溫反應(yīng)1～5h，取出即為CA/PEI-CBA 膜；經(jīng)熱水、甲醇、緩沖溶液等步驟的清洗，干燥保存。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀（ATR-FTIR）分析：取CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI膜，通過ATREQUINOX55 傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定，波數(shù)范圍為500～4000cm-1，分辨率4cm-1，掃描16次。

掃描電鏡（SEM）觀察：取CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI 膜，用液氮冷凍斷裂制樣，用雙面膠黏在SEM樣品臺(tái)上，鍍金，最后通過Hitachi-S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為500或10000倍。

X 射線光電子能譜儀（XPS）測(cè)試：將CA/PEI-CBA 膜或CA/PEI 膜剪成1cm×1cm 的小方塊，采用日本島津公司的Kratos Axis Supra 型X 射線光電子能譜儀進(jìn)行XPS測(cè)試。XPS能譜儀使用功率為72W的單色化的Al Kα射線源，檢測(cè)器與樣品表面的角度為90°，寬譜與窄譜的收集通能分別為100eV、30eV，掃描步長分別為1eV、0.1eV。

膜的失重率測(cè)定：取直徑為φ14cm 的CA/PEI膜的膜片若干，經(jīng)干燥后稱量質(zhì)量為ω0，浸入濃度為0.2～5mg/mL 的CBA 溶液，按照前文所述上染、固色、清洗等步驟制備出CA/PEI-CBA 膜，50℃經(jīng)干燥后稱量質(zhì)量為ω1，膜的失重率δ可由式(1)計(jì)算。

1.3 正交實(shí)驗(yàn)

CA/PEI-CBA 膜制備的條件因素主要有反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）和染料濃度（C）。本文選取以上3 個(gè)因素在4 水平下考察對(duì)CA/PEI-CBA 膜制備和膽紅素吸附的影響，故選用正交表L16(45)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，其因素水平見表1。

表1 CA/PEI-CBA膜制備條件的因素水平

1.4 膽紅素吸附實(shí)驗(yàn)

模擬血清溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量的膽紅素，溶于5mL 0.1mol/L氫氧化鈉水溶液中，再加入20%的人血清白蛋白（HSA）使膽紅素和白蛋白的摩爾比為1∶1，緩慢搖動(dòng)，充分溶解后，用去離子水定容，配成濃度為0.05～0.1g/L的膽紅素溶液。

靜態(tài)吸附：稱取約20mg CA/PEI-CBA 膜，浸入裝有10mL 模擬血清溶液（人血白蛋白與膽紅素摩爾比為1∶1）的小瓶中，小瓶經(jīng)密封、避光處理后，在37℃恒溫條件下以170r/min 轉(zhuǎn)速振蕩2h。等量無膜的模擬血清溶液作為空白樣，在相同條件下進(jìn)行振蕩[21]。膽紅素濃度的測(cè)定采用改良J-G重氮法，在600nm 波長下使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定[31-32]。膽紅素吸附及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在避光條件下進(jìn)行。

模擬血清溶液中的親和膜的膽紅素吸附量可由式(2)計(jì)算。

式中，q為單位質(zhì)量的膜上吸附膽紅素的量，mg/g干膜；C0和Ce分別為空白樣的膽紅素濃度和吸附時(shí)間t后吸附樣中膽紅素的濃度，mg/L；V為吸附體積，L；m為膜片的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 CA/PEI-CBA膜的表征

圖2 繪制了在CBA 濃度5mg/mL、固色反應(yīng)溫度80℃、固色反應(yīng)時(shí)間4h條件下，制備的CA/PEICBA 膜 的ATR-FTIR 光 譜 圖，CA/PEI-CBA 膜 在3300～3500cm-1處吸收峰強(qiáng)度增加，此峰與CBA譜圖中的伯氨基峰相對(duì)應(yīng)，它的增強(qiáng)可能歸因于CBA 在CA/PEI 膜上的擔(dān)載。與CA/PEI 膜的紅外譜圖相比，CA/PEI-CBA 膜在1228cm-1處和1744cm-1處的強(qiáng)吸收峰的峰強(qiáng)幾乎消失，這可能是因?yàn)樵趬A性、高溫的制備條件下，改性膜中的乙酸纖維素發(fā)生了酯基水解，將在2.3節(jié)進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖2 CA/PEI-CBA膜的ATR-FTIR譜圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CBA 的擔(dān)載情況，利用XPS對(duì)CA/PEI 膜和CA/PEI-CBA 膜的表面元素組成進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖3所示。從圖3(a)中可以看出，CA/PEI 膜在結(jié)合能為284.7eV、399.4eV、532.4eV處有吸收峰，分別對(duì)應(yīng)C1s、N1s、O1s，而CA/PEI-CBA 膜在結(jié)合能為167.8eV 處新觀察到S2p峰。CA/PEI-CBA 膜S2p 峰分峰處理結(jié)果如圖3(b)所示，圖3(b)顯示在結(jié)合能等于167.4eV和167.8eV處出現(xiàn)的吸收峰為S==O 和—SO3H 的S2p 峰[33]，證明因接枝CBA分子（圖1）膜上增加了含硫的磺酸基團(tuán)。表2 的數(shù)據(jù)顯示，改性后N 元素含量由5.49%增加至8.74%，說明在引入磺酸基團(tuán)的同時(shí)引入了氨基，表明CBA 分子在CA/PEI 膜上成功擔(dān)載。

2.2 CA/PEI-CBA膜制備條件的優(yōu)化

為了優(yōu)化染料改性膜的制備條件，以膽紅素吸附量為考察指標(biāo)，因素A、B、C的正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果如表3所示。同時(shí)測(cè)定了各條件下的膜失重率，以考察改性條件對(duì)膜的結(jié)構(gòu)是否產(chǎn)生破壞作用。

圖3 CA/PEI-CBA膜的XPS譜圖

表2 CA/PEI-CBA膜的表面元素組成

表3 CA/PEI-CBA膜制備正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

按照文獻(xiàn)[34]分析方法，分別對(duì)膽紅素吸附量和失重率進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表4 和表5，以確定各因素的影響趨勢(shì)和最佳操作水平。

表4 CA/PEI-CBA膜制備正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果膽紅素吸附量的極差分析

表5 CA/PEI-CBA膜制備正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果失重率的極差分析

由表4中極差分析的結(jié)果可知，同一因素各水平的總和為Si，其平均效應(yīng)ki為Si的平均值，ki反映了該水平的效應(yīng)大小。選取同一因素反應(yīng)時(shí)間各水平（1h、2h、3h、4h）的ki進(jìn)行比較，其中k4最大，因此反應(yīng)時(shí)間的最優(yōu)水平為B4，即4h。極差R表示該因素的平均效應(yīng)最大值與最小值之差，差值越大表示影響程度越大。由表4可知，其影響順序?yàn)锽＞C＞A，即影響染料改性膜的膽紅素吸附量的因素依次是反應(yīng)時(shí)間、染料濃度和反應(yīng)溫度。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)方案是A3B4C4，即反應(yīng)時(shí)間4h，染料濃度5mg/mL 和反應(yīng)溫度60℃為最佳反應(yīng)條件。

由表5中極差分析的結(jié)果可知，其影響順序?yàn)锳＞B＞C，即影響失重率的因素依次是反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和染料濃度。結(jié)果表明，膜失重最大時(shí)的反應(yīng)溫度為80℃，如表3所示，在該溫度下制備的膜失重率達(dá)到20%～30%，為了降低染料改性后的膜失重率，盡量降低反應(yīng)溫度。

結(jié)合表4可以看出，決定膽紅素吸附量的重要影響因素為B和C，即反應(yīng)時(shí)間和染料濃度，延長反應(yīng)時(shí)間和增大染料濃度利于膽紅素吸附量的增加。因此，優(yōu)化后的染料改性膜的制備條件為反應(yīng)時(shí)間4h，染料濃度5mg/mL 和反應(yīng)溫度30℃，在此條件下制備的膜失重率較低，為1.9%，膜失重不超過5%，均在可接受范圍內(nèi)。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)CBA 擔(dān)載量和膽紅素吸附量的影響

由正交實(shí)驗(yàn)和權(quán)重分析結(jié)果可知，失重率在染料改性膜的制備過程中影響較大，溫度對(duì)失重的影響最大，因此，重點(diǎn)考察了反應(yīng)溫度對(duì)染料改性膜的CBA擔(dān)載量和膽紅素吸附量的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著反應(yīng)溫度的升高，CBA 擔(dān)載量不斷增大，當(dāng)溫度升高至70℃，CBA 擔(dān)載量由20℃的100μmol/g提高到70℃的580μmol/g。膽紅素吸附量不是隨著CBA 擔(dān)載量單調(diào)變化，在50℃存在吸附最小值，這與預(yù)期的吸附規(guī)律不同，可能歸因于膜基質(zhì)在改性反應(yīng)條件下發(fā)生化學(xué)基團(tuán)和結(jié)構(gòu)的變化。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)膽紅素吸附量和CBA擔(dān)載量的影響

圖5 水解CA和CA/PEI膜ATR-FTIR譜圖

為了確定反應(yīng)溫度對(duì)染料改性膜基膜的影響，首先進(jìn)行了CA膜和CA/PEI膜在堿性溶液中浸泡的空白實(shí)驗(yàn)，其ATR-FTIR 結(jié)果如圖5 所示。CA/PEI膜譜圖中在1744cm-1、1228cm-1和1044cm-1處具有強(qiáng)吸收峰，這是乙酸酯的特征譜帶。水解后CA/PEI 膜在1228cm-1和1744cm-1處峰強(qiáng)明顯降低，與同樣條件下CA 膜水解結(jié)果基本一致，因此可以認(rèn)為水解CA/PEI 膜在1228cm-1和1744cm-1處峰強(qiáng)明顯降低歸因于乙酸纖維素的直接水解。水解CA 膜和CA/PEI膜失重率分別為31.1%和28.5%，有研究顯示，乙酸纖維素失重不超過40%都?xì)w因于其酯基的水解[35]。

其次，在反應(yīng)溫度20℃、40℃、60℃、80℃下制備染料改性膜CA/PEI-CBA 膜，其ATR-FTIR 譜圖如圖6所示。從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，CA/PEI-CBA 膜在1228cm-1處C—O—C 單鍵的伸縮振動(dòng)峰和1744cm-1處C==O 鍵的伸縮振動(dòng)峰峰強(qiáng)不斷減弱，在60℃和80℃下制備的染料改性膜在此位置峰幾乎消失，這與CA/PEI膜和CA膜的水解結(jié)果一致，因此認(rèn)為染料改性過程中發(fā)生了乙酸纖維素的酯基水解。本實(shí)驗(yàn)在高溫下（60～80℃），膜的失重率達(dá)到20%～30%，這也進(jìn)一步說明失重的主要原因是酯基的水解。

圖6 不同溫度下制備的CA/PEI-CBA膜的ATR-FTIR譜圖

為了進(jìn)一步探究膜基質(zhì)變化對(duì)膽紅素吸附的影響，選擇了20℃、40℃、80℃下制備的CA/PEICBA膜進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察，SEM結(jié)果如圖7所示。可以看出，隨著溫度升高，膜基質(zhì)發(fā)生了明顯的變化，膜斷面結(jié)構(gòu)由疏松的海綿狀孔結(jié)構(gòu)逐漸變得致密，孔結(jié)構(gòu)通透性降低，由斷面還可以明顯看到，膜厚度隨反應(yīng)溫度升高而變薄。

圖7 不同改性條件下制備的CA/PEI-CBA膜的斷面SEM圖

這可以解釋膽紅素吸附的趨勢(shì)變化，隨著溫度的升高，CBA 配基的擔(dān)載量增加，染料改性膜的膽紅素吸附量先增加，然后達(dá)到吸附平臺(tái)區(qū)，這可能由于配基的空間位阻導(dǎo)致膽紅素的吸附受阻。繼續(xù)升高溫度，染料改性膜的基質(zhì)結(jié)構(gòu)變得致密，配基CBA 不能有效地接觸和吸附膽紅素，因此，引起了染料改性膜的膽紅素吸附量的迅速降低。但是隨著溫度的升高，更多乙酸纖維素發(fā)生水解，釋放出更多羥基，因羥基也能夠與CBA 發(fā)生反應(yīng)，所以CBA 擔(dān)載量繼續(xù)升高，從而引起膽紅素的吸附量繼續(xù)增加。

2.4 反應(yīng)時(shí)間和染料濃度對(duì)CBA擔(dān)載量和膽紅素吸附量的影響

本文還考察了反應(yīng)時(shí)間（1～5h）和染料濃度（5mg/mL和10mg/mL）對(duì)染料改性膜的CBA擔(dān)載量和膽紅素吸附量的影響，具體結(jié)果如圖8所示。從圖8可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，CBA的擔(dān)載量不斷增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長到4h 后，CBA 擔(dān)載量達(dá)到最大值；染料濃度由5mg/mL 提高到10mg/mL，CBA擔(dān)載量幾乎保持不變，說明在此情況下CBA 達(dá)到飽和。當(dāng)染料濃度5mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為4h 時(shí)，膽紅素吸附量達(dá)到11.0mg/g 膜，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，膽紅素吸附量不再繼續(xù)增大；當(dāng)染料濃度由5mg/mL 增加至10mg/mL 后，隨著反應(yīng)時(shí)間由4h 延長到5h，膽紅素吸附量保持不變，因此反應(yīng)時(shí)間4h和染料濃度5mg/mL為最優(yōu)條件。

圖8 反應(yīng)時(shí)間和染料濃度對(duì)膽紅素吸附量和CBA擔(dān)載量的影響

3 結(jié)論

本文在CA/PEI膜上接枝活性染料汽巴藍(lán)F3GA（CBA），制備出一種染料改性親和膜CA/PEI-CBA膜。以模擬血清溶液中膽紅素吸附量為目標(biāo)設(shè)計(jì)了包括反應(yīng)溫度、染料濃度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)，極差分析可得，影響染料改性膜的膽紅素吸附量的因素從大到小依次是反應(yīng)時(shí)間、染料濃度和反應(yīng)溫度。但是影響失重率的最主要因素是反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度越高，失重率越大。單邊實(shí)驗(yàn)顯示，隨著反應(yīng)溫度的升高，膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，海綿孔結(jié)構(gòu)被破壞，膜變得致密不通透，不利于膽紅素與配基CBA 的接觸，從而影響膽紅素的吸附；在較低反應(yīng)溫度下，延長反應(yīng)時(shí)間和增大染料濃度利于膽紅素的吸附，但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過4h、染料濃度超過5mg/mL 時(shí)，染料改性膜的膽紅素吸附量幾乎不增加。因此最終的實(shí)驗(yàn)條件確認(rèn)為反應(yīng)時(shí)間4h、CBA濃度5mg/mL、反應(yīng)溫度30℃。