Mir-125b和PIGF在早期流產(chǎn)孕婦絨毛組織及血清中的表達(dá)及意義

楊艷華， 吳 軍， 嚴(yán) 格

(湖北省天門(mén)市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 湖北 天門(mén) 431700)

流產(chǎn)分為自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)，其中自然流產(chǎn)發(fā)生率占全部妊娠的15%左右，多發(fā)生在12周前，病因復(fù)雜，包括遺傳、免疫、感染、甚至器官異常、配偶等因素等[1]。然而仍有部分自然流產(chǎn)發(fā)生原因不明，子宮胎盤(pán)循環(huán)異?？赡芷鹬匾饔?，但尚不完全明確。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在絨毛膜中表達(dá)水平降低與稽留流產(chǎn)有關(guān)。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)是VEGF家族中的一員，能夠促進(jìn)早孕時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖分化及遷移過(guò)程，對(duì)絨毛膜、腫瘤血管形成發(fā)揮重要作用[2]。檢測(cè)血清PIGF對(duì)胎盤(pán)功能評(píng)價(jià)及子癇前期預(yù)測(cè)有重要價(jià)值。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的非編碼RNA，可通過(guò)抑制其下游靶基因參與機(jī)體多種疾病發(fā)生。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中微小RNA-125b(mir-125b)可靶向維生素D受體，參與胎盤(pán)形成及其生長(zhǎng)發(fā)育及滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡[3]。但關(guān)于mir-125b與PIGF在自然流產(chǎn)中的表達(dá)及關(guān)系尚鮮有報(bào)道，因此本研究擬檢測(cè)自然流產(chǎn)患者中mir-125b和PIGF表達(dá)，以探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年7月至2019年10月本院收治的孕早期自然流產(chǎn)婦女105例為研究對(duì)象，年齡18-35歲，平均年齡(29.13±5.54)歲，平均體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)為(22.91±2.46)Kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.97±1.57)周，有吸煙史者12例，飲酒史者41例。另選擇105例人工流產(chǎn)孕婦為對(duì)照組，年齡18-35歲，平均年齡(28.13±5.27)歲，BMI(22.67±2.25)kg/m2，孕周4-12周，平均孕周(7.65±1.54)周，有吸煙史者8例，飲酒史者32例。兩組受試者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)天門(mén)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，另獲得受試者同意并簽字確認(rèn)。自然流產(chǎn)女性納入標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠12周內(nèi)自然流產(chǎn)流產(chǎn)孕婦；②彩超提示宮內(nèi)妊娠，但無(wú)胚芽和心管搏動(dòng)；③白帶檢查、超聲檢查無(wú)異常；④男方精液檢查正常，夫妻雙方無(wú)染色體異常。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠12周內(nèi)要求人工流產(chǎn)正產(chǎn)妊娠者；②無(wú)陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀；③彩超檢查胚胎正常，有胚芽和心管搏動(dòng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖道畸形或發(fā)生感染者；②有既往不良妊娠史或流產(chǎn)史者；③合并高血壓、心臟病、甲狀腺疾病、腎病等疾病患者；④不自愿參加本次調(diào)查研究者；⑤就診前3個(gè)月使用甾體類(lèi)激素者；⑥子宮內(nèi)膜炎或其他可引起流產(chǎn)的慢性傳染病等。

1.2主要試劑及儀器:microRNA定量(qRT-PCR)試劑盒(批號(hào)：638315)、TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(批號(hào)：RR820A)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PIGF ELISA試劑盒(批號(hào)：EHPGF)、鼠源PIGF抗體(批號(hào)：MA1-188)、GAPDH抗體(批號(hào)：AM4300)、二抗羊抗鼠IgG(批號(hào)：B-2752)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。紫外分光光度計(jì)、MODEL550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；7500型RT-qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3方 法

1.3.1樣本采集:所有女性流產(chǎn)組織取出后，無(wú)菌條件下用PBS沖洗，濾紙吸干，將周?chē)Y(jié)締組織去除后，分離絨毛膜組織，分裝于2.0mL凍存管，置于液氮中保存待檢。采集所有受試者空腹外周靜脈血，常規(guī)分離血清，置于-80℃冰箱待檢。

1.3.2絨毛膜組織中mir-125b、PIGF mRNA水平檢測(cè):絨毛膜組織樣品總RNA采用Trizol提取，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，保存于-20℃，備用。mir-125b、PIGF mRNA表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)。20μL反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4μL ，cDNA(50 ng/μL)2μL，上下游引物(10 μM)各0.8μL，dd H2O 6.0μL。反應(yīng)條件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，共40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。mir-125b、PIGF mRNA及內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成。采用2-△△CT法對(duì)絨毛膜組織中mir-125b、PIGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3絨毛膜組織中PIGF蛋白水平檢測(cè):應(yīng)用蛋白抽提試劑盒將絨毛膜組織總蛋白提取，蛋白濃度采用BCA試劑盒檢測(cè)，并保存于-80℃冰箱，備用。60g蛋白樣品在6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h(電壓80mV)，PVDF膜轉(zhuǎn)膜70min(恒流250 mA)。然后在室溫條件下，5%脫脂奶粉封閉2 h，并加入適量PBS稀釋(含2%脫脂奶粉)，后加一抗(PIGF抗體1:500；GAPDH抗體1:500)，在4 ℃下孵育過(guò)夜，并應(yīng)用TBST緩沖液洗膜3次，20 min/次，用適量PBS稀釋(含2%脫脂奶粉)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG(1:5000)在室溫條件下孵育1.5h，依次洗膜，顯色，曝片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.3.4血清mir-125b、PIGF水平檢測(cè):血清mir-125b方法采用RT-qPCR，同1.4.2。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清PIGF水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性一般資料比較:對(duì)比年齡、BMI、孕周、吸煙史、飲酒史比例，對(duì)照組、自然流產(chǎn)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性一般資料比較

2.2自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性絨毛膜組織及血清mir-125b、PIGF表達(dá)水平比較:與對(duì)照組比較，自然流產(chǎn)組女性絨毛膜組織mir-125b水平顯著升高、PIGF mRNA水平顯著降低，血清mir-125b水平顯著升高、PIGF水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性絨毛膜組織中mir-125b PIGF表達(dá)水平比較

2.3自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白表達(dá)水平比較:與對(duì)照組比較，自然流產(chǎn)組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖1。

表4 自然流產(chǎn)組及對(duì)照組女性絨毛膜組織中PIGF蛋白表達(dá)水平比較

圖1 WB檢測(cè)絨毛膜組織中PIGF蛋白表達(dá)

2.4自然流產(chǎn)女性絨毛膜組織、血清mir-125b、PIGF表達(dá)水平相關(guān)性分析:Pearson法分析結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)女性絨毛膜組織、血清mir-125b水平與PIGF蛋白水平均呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.643、-0.691，P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

2.5血清mir-125b、PIGF水平對(duì)孕早期自然流產(chǎn)患者的預(yù)測(cè)價(jià)值:分別以血清mir-125b、PIGF水平及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)值為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清mir-125b、PIGF水平預(yù)測(cè)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的曲下面積(area under the curve，AUC)分別為0.896(95%CI：0.850-0.943)、0.884(95%CI：0.838-0.929)，mir-125b≥1.630預(yù)測(cè)自然流產(chǎn)發(fā)生的靈敏度為95.30%，特異度為84.60%，PIGF≤42.553 pg/mL預(yù)測(cè)自然流產(chǎn)發(fā)生的靈敏度為90.60%，特異度為77.90%；二者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的AUC為0.954，靈敏度為89.60%，特異度為92.30%。詳見(jiàn)圖3，表5。

圖2 自然流產(chǎn)女性絨毛膜組織、血清中mir-125b、PIGF表達(dá)水平相關(guān)性分析

圖3 血清mir-125b、PIGF水平對(duì)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線

表5 血清mir-125b PIGF水平對(duì)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

妊娠是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，妊娠后滋養(yǎng)層細(xì)胞血管形成可為胚胎提供氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保證胚胎正常發(fā)育。如果著床后絨毛血管發(fā)育異常或生成不足，則將發(fā)生流產(chǎn)。VEGF是一種特殊的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，促進(jìn)血管生成，在正常人中表達(dá)水平低，在胚胎組織、胎盤(pán)及妊娠期子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)[4]。PIGF是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，屬于VEGF家族，其堿基序列與VEGF同源性高，通過(guò)特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(VEGFR-1)/fms樣酪氨酸激酶受體-1(Flt-1)受體發(fā)揮與VEGF相似的生物學(xué)功能[5]。研究報(bào)道，正常妊娠時(shí)，隨妊娠進(jìn)展血清中PIGF水平呈峰形，健康孕婦血清PIGF妊娠過(guò)程中的變化：孕5～15周PLGF水平低，15-26周PIGF表達(dá)迅速增加，在妊娠28～30周達(dá)高峰，檢測(cè)PIGF水平可用于評(píng)估胎盤(pán)功能及子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及危險(xiǎn)分層[6]。鄭海娜等[7]研究報(bào)道，孕早期子癇前期孕婦血清PIGF水平顯著低于正常健康孕婦，且子癇前期血清PIGF水平隨病情嚴(yán)重程度增加而降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，自然流產(chǎn)患者絨毛膜組織PIGF mRNA及蛋白、血清PIGF水平均顯著降低，提示PIGF表達(dá)降低可能與孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生有關(guān)。miRNA在真核生物中經(jīng)Dicer酶加工后形成小分子RNA，具有高度保守型、時(shí)序性和組織特異性。mir-125家族進(jìn)化過(guò)程中非常保守，由mir-125a、mir-125b-1、mir-125b-2三個(gè)成員組成，mir-125家族異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[8]。Nie等[9]研究研究發(fā)現(xiàn)，mir-125b在三陰性乳腺癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)水平均顯著高于正常乳腺組織及細(xì)胞系，下調(diào)mir-125b可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。李建華等[10]研究報(bào)道，mir-125在肝癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，且在肝癌細(xì)胞中，甲基化抑制劑可顯著上調(diào)其表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mir-125b在自然流產(chǎn)患者絨毛膜組織、血清表達(dá)水平顯著增加，與李建華[10]在肝癌中的結(jié)果不符，可能miR-125b在不同疾病中表達(dá)模式不同，本研究發(fā)還發(fā)現(xiàn)mir-125b與PIGF蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示mir-125b表達(dá)水平上調(diào)可能通過(guò)抑制PIGF表達(dá)，與自然流產(chǎn)發(fā)生有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清mir-125b、PIGF水平預(yù)測(cè)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生的AUC分別為0.896、0.884，mir-125b≥1.630預(yù)測(cè)自然流產(chǎn)發(fā)生的靈敏度為95.30%，特異度為84.60%，PIGF≤42.553pg/mL預(yù)測(cè)自然流產(chǎn)發(fā)生的靈敏度為90.60%，特異度為77.90%；二者聯(lián)合檢測(cè)AUC高達(dá)0.954，特異度高達(dá)92.30%，但靈敏度略下降，提示檢測(cè)血清mir-125b、PIGF水平對(duì)孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，靈敏度有待提高。

綜上所述，早期自然流產(chǎn)孕婦絨毛膜組織中mir-125b水平上調(diào)，PIGF水平下調(diào)，且二者呈負(fù)相關(guān)，可能對(duì)自然流產(chǎn)發(fā)生有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關(guān)于mir-125b與PIGF在自然流產(chǎn)患者中是否存在靶向調(diào)控關(guān)系及具體機(jī)制、涉及相關(guān)通路及聯(lián)合診斷的最佳閾值有待進(jìn)一步深入探索。