花鱸低氧誘導(dǎo)因子基因(hifs)的序列分析及低氧誘導(dǎo)表達(dá)*

張凱強(qiáng)， 常志成， 溫海深， 李吉方， 齊 鑫， 張曉燕， 李 昀

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

花鱸(Lateolabraxmaculatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鱸屬(Lateolabrax)，俗名海鱸、鱸魚、七星鱸、寨花等，廣泛分布于中國沿海以及朝鮮沿海，是中國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類[1]。由于花鱸具有廣溫廣鹽性的特點(diǎn)，已經(jīng)成為南北方網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要對象，養(yǎng)殖規(guī)模正逐步擴(kuò)大。同時花鱸耐受能力強(qiáng)，是環(huán)境因子脅迫研究的理想對象。

溶解氧是影響水生動物生長、代謝等生命活動的重要環(huán)境因子，是維持水生動物生存的基本條件[2]。而當(dāng)今人口增長、溫室效應(yīng)，魚類高密度養(yǎng)殖等因素致使魚類面臨著低氧環(huán)境的威脅，低氧對魚類的生長、存活、行為、生理生化以及發(fā)育和繁殖等產(chǎn)生影響[3]。生物體在適應(yīng)低氧環(huán)境的長期進(jìn)化中已經(jīng)形成了一系列的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這些基因能夠接受低氧信號的調(diào)節(jié)并參與低氧應(yīng)答，是低氧應(yīng)答機(jī)制中重要的分子基礎(chǔ)[4]。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factors，hifs)是其中的關(guān)鍵基因之一，在生物體的環(huán)境缺氧應(yīng)答機(jī)制中起著非常重要的作用。

低氧誘導(dǎo)因子(hifs)最先由Semenza等[5]在低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)，是由α和β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIFa亞基主要包括3種：HIF1α、HIF2α和HIF3α三者均受氧氣濃度的調(diào)節(jié)與影響，并能夠使HIF的活性發(fā)生變化[6]。HIF1b也稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，arnt)，是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對氧濃度的變化不敏感，其功能主要與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體參與調(diào)控過程，如低氧下與HIFa聚合成二聚體參與低氧基因的調(diào)控[7-10]以及參與器官形成、神經(jīng)發(fā)育[18]等。hifs基因在催化低氧相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，研究表明hifs可通過與低氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Element, HRE)相結(jié)合來調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而參與低氧狀態(tài)機(jī)體的生理響應(yīng)，例如：促進(jìn)紅細(xì)胞生成、血管生成，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，線粒體代謝和凋亡等[7-8,11-12]。

目前，關(guān)于魚類hifs的研究主要集中在hifα亞基[13-15]。有關(guān)花鱸低氧調(diào)控的研究也較少，其分子機(jī)制尚不清楚。本研究對花鱸4個hifs基因序列進(jìn)行了全面的分析研究，同時利用實(shí)時熒光定量PCR手段檢測了花鱸hifs在各組織中的表達(dá)模式，對hifs在低氧脅迫下的表達(dá)變化以及相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究結(jié)果為深入研究花鱸4個hifs基因在低氧調(diào)控中的功能提供了理論基礎(chǔ)，同時為了解其它魚類在低氧脅迫時機(jī)體的生理調(diào)控與分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)于中國海洋大學(xué)魚類繁殖生理與種子工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)對象為體長(21.43±0.77)cm、體重(149.20±19.22)g的花鱸幼魚。實(shí)驗(yàn)用魚于400 L的塑料圓桶中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間溶氧為7.5～8.0 mg/L，溫度為(19±0.5)℃，鹽度為30。每天09:00和17:00投餌2次，投餌后清除殘餌并換水。實(shí)驗(yàn)開始前一天停止投喂。

1.2 低氧脅迫實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)容器為3個400 L的塑料圓桶，實(shí)驗(yàn)開始前通過快速注入氮?dú)鈦斫档腿苎鹾?，利用溶氧儀(YSI DO200)來實(shí)時監(jiān)測桶內(nèi)溶氧水平。當(dāng)溶氧量達(dá)到2 mg/L時，往3個實(shí)驗(yàn)圓桶內(nèi)平均放入40尾花鱸幼魚，適應(yīng)10 min后開始計(jì)時，期間通過注入少量空氣以及適量氮?dú)鈦砭S持桶內(nèi)溶解氧的相對穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)分為低氧脅迫與常氧恢復(fù)兩個階段，低氧為(1.56±0.24)mg/L，低氧脅迫24 h。24 h后通過迅速注入純氧使氧氣水平達(dá)到8 mg/L，期間通過注入純氧和適量氮?dú)鈦砭S持溶解氧的相對穩(wěn)定，常氧維持在(7.72±0.18)mg/L。低氧脅迫期間的取樣時間點(diǎn)分別為3、6、12和24 h，復(fù)氧取樣時間點(diǎn)分別為3和12 h。

1.3 樣品采集與處理

對低氧脅迫與常氧恢復(fù)的各時間點(diǎn)以及暫養(yǎng)桶中樣品進(jìn)行取樣，其中暫養(yǎng)桶中樣品作為對照組取樣，每個桶每個時間點(diǎn)各取樣3尾花鱸幼魚，用MS-222(200 mg/L)進(jìn)行麻醉，然后快速解剖進(jìn)行肝、鰓、肌肉、腦、垂體、心臟、腸、胃、脾、腎組織的取樣。樣品迅速放于液氮中速凍后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取與cDNA的合成

總RNA的提取采用Trizol (Invitrogen, USA)提取法。cDNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A Takara)試劑盒說明書進(jìn)行合成。合成的cDNA暫時存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 花鱸4個hifs基因序列與進(jìn)化分析

花鱸4個hifs基因序列來自花鱸基因組(未公開)及轉(zhuǎn)錄組(SRR4409341 (LS)和 SRR4409397 (HS))，通過NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析軟件進(jìn)行比對，初步確定各基因，利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線分析軟件，對確定的基因序列進(jìn)行閱讀框、氨基酸序列推定。同時通過DNAMAN Version 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性的比較。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步確定各基因，采用的方法為鄰接法(Neighbor-joining, NJ)，bootstrap數(shù)值為1 000。

1.6 共線性分析

為進(jìn)一步注釋花鱸4個hifs基因，本研究進(jìn)行了共線性分析。共線性分析是基于花鱸4個hifs基因與其它物種對應(yīng)基因間臨近基因進(jìn)行對比建立起來的。對于hifs各基因臨近基因的查找來自花鱸基因組，其它物種基因位置的確定來自Genomicus[16]和Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www.ensembl.org/)。

1.7 花鱸4個hifs基因?qū)崟r熒光定量PCR(qRT-PCR)表達(dá)分析

根據(jù)花鱸基因組4個hifs基因序列，設(shè)計(jì)相關(guān)qRT-PCR引物(見表1)。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系包括：10 μL SYBR?FAST qPCR Master Mix (2×)，0.4 μL ROX Reference Dye (50×)，2 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL以及6.8 μL的ddH2O。使用Step One Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems)PCR儀進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃，5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。18s RNA作為內(nèi)參基因，基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

表1 實(shí)時定量PCR表達(dá)分析的引物序列Table 1 Primer sequences for mRNA expression analysis

1.8 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較，以P<0.05作為差異顯著水平，用Excel2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 花鱸4個hifs基因序列分析

對花鱸hifs基因序列信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表2)。如表2所示，hifs基因CDS序列長度范圍為2 043～2 676 bp，分別編碼733～891個氨基酸。用于花鱸hifs基因同源性分析的物種包括人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、斑馬魚(Daniorerio)。對花鱸hifs基因與以上物種同源性分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表3)。如表3所示，hif1a與其它物種同源性為59.8%～65.1%，hif2a為48.8%～61.6%，hif3a為39.9%～58.5%，hif1b為59.6%～82.0%。

表2 hifs基因序列信息統(tǒng)計(jì)

表3 花鱸與其他物種hifs基因間氨基酸序列比對Table 3 Comparison of the amino acid sequences of the hifs genes between the spotted sea bass and other species

2.2 花鱸4個hifs基因系統(tǒng)進(jìn)化與共線性分析

對花鱸和不同物種的4個hifs基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖1)。如圖1所示，選擇的物種主要包括人、鼠、雞、斑馬魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、青鳉(Oryziaslatipes)等。進(jìn)化樹共分為兩大分支：hif1α、hif2α和hif3α共同聚為其中一個較大的分支；同時又分為兩個分支，其中hif1α和hif2α聚為一支，說明hif1α和hif2α同源關(guān)系相對較近，hif3α單獨(dú)聚為一支。而hif1β單獨(dú)聚為另一分支。說明hif1β在進(jìn)化關(guān)系上與hif1α、hif2α和hif3α同源性相對較遠(yuǎn)。

(黑色圓點(diǎn)表示花鱸hifs基因。The black dots in the chart indicate the positions of the hifs genes.)圖1 花鱸和其它物種hifs基因的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹

對花鱸和不同物種的4個hifs基因進(jìn)行共線性分析(見圖2)。如圖2所示，用于共線性分析的物種為人、鼠、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰。對于hif1α基因(見圖2(A))，花鱸與虹鱒具有相同的臨近基因trmt5，花鱸與人也具有相同的臨近基因trmt5，但排列順序相反，其它相同基因的排列順序不一致?；|和人、鼠hif2α基因臨近的pigf、msh2基因相同(見圖2(B))?；|hif3a基因與人、鼠有相同臨近基因pak4(見圖2(C))。對于hif1β基因(見圖2(D))，花鱸與斑點(diǎn)叉尾鮰具有相同的臨近基因rps9和cnot3，花鱸與人臨近基因相同但排列順序不同。因此，各hif基因的共線性相對保守，進(jìn)一步證明本研究對花鱸hif基因注釋的正確性。

((A)表示hif1α基因；(B)表示hif2α基因；(C)表示hif3α基因；(D)表示hif1β基因。(A) indicatedhif1αgene; (B) indicatedhif2αgene;(C) indicatedhif3αgene;(D) indicatedhif1βgene.)

圖2 花鱸和其它物種hifs基因共線性分析

Fig.2 Syntenic analysis forhifs genes in spotted sea bass and other species

2.3 花鱸4個hifs基因在10個組織中的表達(dá)分析

花鱸10個組織分別為肝、鰓、肌、腦、垂、心、腸、胃、脾、腎。其中以表達(dá)量較小的肌肉組織作為參照，進(jìn)行4個hifs基因相對表達(dá)量的計(jì)算(見圖3)。由圖3可知，hifs基因在10個組織中的表達(dá)情況不同，其中hif1α在花鱸脾中表達(dá)量最高，其表達(dá)量是肌肉16.59倍，在肌肉中表達(dá)量最低，其它組織依次為心臟，鰓，腎，腸，肝，胃，垂體，腦；hif2α在肌肉、腦中的表達(dá)量較低，而在鰓中的表達(dá)量最高，約為肌肉中的24.76倍；hif3α在腸和胃中表達(dá)相對較高，其次為脾臟、心臟和腎，其它組織的表達(dá)量相對較低；hif1β在鰓組織中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量約為肌肉的22.33倍。

2.4 花鱸4個hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以對照組0 h基因的表達(dá)量為參照，測定了低氧脅迫與常氧恢復(fù)階段花鱸肝組織和鰓組織hifs基因的表達(dá)情況(見圖4和5)。由圖4和5可知，hifs各個基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)時間和響應(yīng)程度存在顯著差異。如圖4所示，肝組織中，低氧脅迫3 h后，hifs基因相對表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著升高(P<0.05)，其中hif1α、hif2α、hif3α分別升高了3.76，3.81，3.82倍，hif1β升高2.51倍；低氧脅迫12 h后，僅有hif1α表達(dá)量仍顯著高于對照組(P<0.05)；低氧脅迫24 h以及恢復(fù)正常溶氧3和12 h時，各基因的表達(dá)量與對照組相比均沒有顯著差異。如圖5所示，鰓組織中，低氧脅迫3 h后，hif1α、hif2α與hif3α相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，其中hif1α升高2.43倍，hif2α升高1.76倍，hif3α升高6.89倍；低氧脅迫6h后，僅hif3α、hif1β基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，hif3α相對表達(dá)量升高6.01倍，hif1β則升高2.11倍；而其它時間點(diǎn)各基因相對表達(dá)量均無顯著差異。

(10個組織從左至右分別為：1：肝，2：鰓，3:肌肉，4:腦，5:垂體，6:心臟，7:腸，8:胃，9:脾，10:腎。The order of ten tissues from left to right: 1:liver, 2:gill, 3:muscle, 4:brain, 5:pituitary, 6:heart, 7:intestine, 8:stomach, 9:spleen, 10:kidney.)

圖3 花鱸hifs基因在不同組織中的表達(dá)情況

Fig.3 The expression ofhifs genes of spotted sea bass in different tissues

(0～24 h為低氧脅迫期間的取樣時間點(diǎn)，R3h和R12h為復(fù)氧取樣時間點(diǎn)。0～24 h is the sampling time point during hypoxic stress,R3h and R12h is the sampling time point during reoxygenation.The same as below.)

圖4 低氧脅迫下hifs基因在花鱸肝臟中的表達(dá)情況

Fig.4 The expression profile ofhifs genes of spotted sea bass in liver tissue under hypoxia challenge

圖5 低氧脅迫下hifs基因在花鱸鰓中的表達(dá)情況

3 討論

溫室效應(yīng)等導(dǎo)致的全球變暖，以及魚類高密度養(yǎng)殖，經(jīng)常會使養(yǎng)殖水體出現(xiàn)短期的急性缺氧狀況，嚴(yán)重的急性缺氧會造成“翻塘”，引起魚類的瞬間大量死亡，對養(yǎng)殖生產(chǎn)造成大量的損失。因此，研究與低氧脅迫相關(guān)的基因在急性低氧中的表達(dá)情況，對魚類低氧應(yīng)答研究具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。在本實(shí)驗(yàn)中，我們從花鱸4個hifs基因鑒定、基因組織表達(dá)和低氧誘導(dǎo)hifs表達(dá)三個方面探索了急性低氧對花鱸hifs基因的影響。

3.1 花鱸hifs基因序列分析

本文4個hifs基因序列均來自花鱸基因組，其氨基酸長度分別為818、891、680和733 aa，各基因長度與其他物種相似，說明各基因在進(jìn)化過程中保持著較強(qiáng)的保守性，這可能與其生物學(xué)功能相關(guān)?；?個hifs基因氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹中，各基因首先與魚類聚為一支，然后在與哺乳類聚在一起，這與Mu等[15]和Shen等[17]對hif1α和hif2α的研究結(jié)果相一致。共線性結(jié)果表明hifs各基因與相應(yīng)物種具有相同的臨近基因，進(jìn)一步證明了本研究對花鱸4個hifs基因命名的準(zhǔn)確性。

3.2 hifs基因在花鱸10個組織中的差異表達(dá)分析

花鱸hifs基因在10個組織中的表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：hifs基因在不同組織的表達(dá)豐度不同，如hif1α在花鱸的脾臟中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)最低，hif2α在鰓中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)最低，hif3α在胃中表達(dá)最高，鰓中表達(dá)最低；hif1β表達(dá)量在鰓組織中最高，肌肉組織中最低?？傮w而言，花鱸hifs表達(dá)量在鰓、脾臟、胃中相對較高，而在肌肉中相對較低，表明hifs表達(dá)具有組織特異性。姜華鵬等[18]對高原軟刺裸鯉(Gymnocyprisdobula)hif1B和hif2A的研究得到了與本實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，其在鰓中表達(dá)量最高，而在脾臟、腦和皮膚中的表達(dá)量較低。而張慧[19]對黃顙魚(Pelteonagrusfulvidsco)hif1α的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)不同，其在肝臟中相對表達(dá)量最高，腎臟次之，鰓中最少。相似的Mohindra V等[20]對印度鯰(Clariasbatrachus)hifα的研究與本研究結(jié)果也不一致，其表達(dá)量均在腦中最高。以上結(jié)果表明，hifs的表達(dá)同時具有物種差異性。

3.3 低氧誘導(dǎo)hifs在花鱸肝、鰓組織中的表達(dá)分析

魚類鰓器官是魚體的主要呼吸器官并且與外界水環(huán)境直接接觸，最先感知水體溶解氧的變化，同時鰓表面積大，具有調(diào)節(jié)滲透壓、酸堿平衡，排泄廢物等功能，相比于其他器官更容易受到低氧脅迫的影響，對魚類的生長造成威脅[21-22]。同時肝臟是動物在低氧脅迫時進(jìn)行代謝調(diào)整的關(guān)鍵器官[23]，并且低氧會誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡[24-25]。研究花鱸hifs在低氧脅迫下鰓、肝組織中的表達(dá)情況，對研究花鱸的低氧應(yīng)答機(jī)制具有理論意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)時間和響應(yīng)程度存在一些差異。肝組織中，低氧脅迫3 h后，hifs基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著升高，說明在低氧條件下肝器官能夠迅速做出應(yīng)對；而低氧脅迫12 h后，僅hif1α表達(dá)量顯著高于對照組，其余基因與對照組相比差異不顯著，由此可以看出hif1α基因在肝組織低氧調(diào)控12 h內(nèi)持續(xù)起作用，而其它hifs基因僅在前6 h起作用。在鰓組織中，與肝組織中的變化規(guī)律相似，低氧脅迫3 h后hif1α、hif2α、hif3α顯著升高，hif1β基因表達(dá)無顯著差異。說明前3 h的低氧脅迫中，在鰓組織僅hifα基因起調(diào)控作用。而低氧脅迫6 h后，hif1β基因與hif3α基因表達(dá)量顯著升高，其他基因表達(dá)無顯著變化，說明6 h后，hif3α和hif1β基因共同調(diào)控低氧脅迫。關(guān)于其他魚類hifα的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似，如印度鯰[20]、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)[26]、河鱸(Percafluviatilis)[27]低氧脅迫后，肝中hifa基因的表達(dá)量顯著升高，斑點(diǎn)叉尾鮰[14]受低氧脅迫5 h后，hifα各基因在鰓、肝中表達(dá)量均顯著升高，許氏鲆鮋(Sebastesschlegeli)[15]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[17]低氧脅迫后，分別在肝、鰓組織中hif2α表達(dá)量顯著升高。在hifs中，常氧條件下α亞基沒有活性，當(dāng)處于低氧環(huán)境時，α亞基會迅速被激活并與相應(yīng)的低氧靶基因反應(yīng)元件結(jié)合，促使基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引發(fā)低氧應(yīng)答[28]。β亞基則較為穩(wěn)定，需與α亞基構(gòu)成二聚體后響應(yīng)低氧脅迫。在本實(shí)驗(yàn)中，肝組織中hif1β基因在低氧3和6 h顯著升高，說明花鱸肝組織中hif1β基因可能是配合hifα基因的升高，相互作用共同響應(yīng)低氧應(yīng)答。相似的，鰓組織中在低氧脅迫6 h時hif1β、hif3α顯著升高，此時可能是其相互作用響應(yīng)低氧脅迫。hifs基因在對低氧的響應(yīng)時間以及強(qiáng)度上存在顯著差異，反映出各個基因在低氧應(yīng)答中所起的作用以及表達(dá)模式不同，其具體的調(diào)控模式與分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

低氧誘導(dǎo)因子hifs是低氧應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在魚類的環(huán)境缺氧應(yīng)答中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)鑒定、分析了花鱸4個hifs基因：hif1α、hif2α、hif3α、hif1β，并檢測了各個基因的組織表達(dá)情況。結(jié)果表明花鱸4個hifs基因存在組織表達(dá)特異性，說明hifs參與了不同的生物學(xué)過程。進(jìn)一步對hifs基因進(jìn)行低氧脅迫后肝、鰓組織中的表達(dá)分析，結(jié)果表明不同基因在不同組織中對低氧的響應(yīng)時間和響應(yīng)程度存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)對花鱸hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)模式進(jìn)行了初步的研究，其具體的生理與分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。