pH和緩沖作用對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

段應(yīng)策，胡姿儀，楊帆，李金濤，鄔向麗，張瑞穎

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

0 引言

【研究意義】香菇（Lentinula edodes）是中國(guó)食用菌中重要的大宗栽培種類，不僅味道鮮美，還有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，深受市場(chǎng)歡迎。近年來(lái)香菇生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，栽培技術(shù)也發(fā)生了巨大的變化，工廠化制棒和液體菌種技術(shù)開始廣泛應(yīng)用。工廠化制棒對(duì)質(zhì)量控制提出了更高的要求，pH是衡量培養(yǎng)料質(zhì)量和培養(yǎng)條件的一個(gè)重要指標(biāo)[1]，在香菇菌棒工廠中，大量木屑通常是露天堆放，被雨淋濕后，易發(fā)酵變酸[2]。生產(chǎn)中通常添加石灰將木屑 pH調(diào)至6.0—7.0，但仍然經(jīng)常出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)緩慢甚至不萌發(fā)的現(xiàn)象。在液體菌種發(fā)酵過(guò)程中，pH不斷下降，后期有時(shí)能降至pH 2.5以下，對(duì)菌種質(zhì)量的影響尚不清楚。因此，亟需深入研究pH對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響機(jī)制，為香菇生產(chǎn)和新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】pH是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要因子。不同食用菌對(duì) pH的要求不同，平菇（Pleurotus ostreatus）能在pH 4.0—7.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但pH 6.0時(shí)生長(zhǎng)速度最高[3]，金針菇（Flammulina velutipes）液體發(fā)酵的最適pH為5.5—7.4[4]，黑木耳（Auricularia heimuer）菌絲生長(zhǎng)的最適pH為7.0[5]。有些食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基質(zhì)pH是動(dòng)態(tài)變化的，香菇菌棒在培養(yǎng)過(guò)程中，pH不斷下降，在出菇前達(dá)到pH 4.0，有報(bào)道建議將pH 4.0作為衡量香菇菌棒生理成熟的一個(gè)指標(biāo)[6]。大多數(shù)真菌通過(guò)合成草酸調(diào)控基質(zhì)pH[7]，草酰乙酸水解酶和乙醛酸脫氫酶是真菌合成草酸的主要酶[8-10]，香菇中草酰乙酸水解酶基因已經(jīng)被成功克隆[11]。【本研究切入點(diǎn)】香菇菌絲能夠在pH 3.0—7.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，傳統(tǒng)上認(rèn)為香菇對(duì)基質(zhì)pH的適應(yīng)性較強(qiáng)，缺乏精確和系統(tǒng)的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究為了探索 pH對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，首先利用HCL和NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH，檢測(cè)菌絲生長(zhǎng)的最適pH；然后分析木屑中尤其是酸化木屑中的有機(jī)酸，利用有機(jī)酸、鈣鹽和緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，檢測(cè)其對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，揭示 pH和緩沖作用對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所進(jìn)行。

1.1 菌株

香菇菌株由國(guó)家食用菌標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)（China center for mushroom spawn standards and control，CCMSSC）提供，編號(hào)為CCMSSC 04311，品種名為L(zhǎng)808，是國(guó)內(nèi)常用的一個(gè)主栽品種。

1.2 培養(yǎng)基制備

為了檢測(cè)有機(jī)酸和鈣鹽對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，在PDA培養(yǎng)基（DifcoTM）中分別添加有機(jī)酸和鈣鹽，有機(jī)酸為檸檬酸和乳酸；鈣鹽為檸檬酸鈣、乳酸鈣、硫酸鈣和碳酸鈣。每種物質(zhì)設(shè)置3個(gè)濃度，分別為5、25和50 mmol·L-1。未添加有機(jī)酸和鈣鹽的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK）。

為了檢測(cè)pH對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，設(shè)計(jì)5個(gè)pH梯度，分別為pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0和pH 7.0。利用3種方法分別調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH，第一種是用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)；第二種是利用25和50 mmol·L-1的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（CBS）調(diào)節(jié)；第三種是利用25和50 mmol·L-1磷酸-磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（PBS）調(diào)節(jié)。利用平面樣品pH電極（梅特勒）測(cè)定PDA培養(yǎng)基的pH。

1.3 木屑中有機(jī)酸的提取

從香菇菌棒廠分別取酸化木屑和正常木屑，用塑料袋封裝帶回實(shí)驗(yàn)室。稱取10 g木屑樣品，加20 mL水，勻漿；超聲波處理30 min；50℃水浴30 min；10 000 r/min離心 10 min，取10 mL上清液，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，用pH電極（梅特勒）測(cè)定pH。

1.4 GC-MS分析

利用GC-MS進(jìn)行有機(jī)酸的定性分析。GC-MS分析之前，利用硅烷化方法對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理[12-13]。將過(guò)濾液冷凍干燥；加100 μL甲氧胺的吡啶溶液（20 mg·mL-1），38℃反應(yīng) 90 min；加入 100 μL的 N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-trimethylsilytrifluoroacetamide，MSTFA）反應(yīng)30 min。

有機(jī)酸樣品衍生化之后直接進(jìn)行GC-MS分析[14]，色譜柱為DB-5MS（50 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為70℃保持2 min，4℃·min-1升至300℃，保持10 min；質(zhì)譜掃描范圍為33—500 m/z；進(jìn)樣量1 μL；內(nèi)標(biāo)為己二酸。

1.5 HPLC分析

利用HPLC進(jìn)行有機(jī)酸的定量分析[15-16]，儀器為Agilent1100，有機(jī)酸分析柱 SB-Aq，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相為硫酸溶液（pH 1.96）和甲醇（色譜級(jí)），配比為 9﹕1；柱溫為 30℃；流速 0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中有機(jī)酸的含量。

1.6 生長(zhǎng)速度測(cè)定

每個(gè)培養(yǎng)皿裝20 mL培養(yǎng)基，接種后25℃避光培養(yǎng)，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度和抑制率[17]。菌絲生長(zhǎng)速度（mm·d-1）=菌落直徑/培養(yǎng)天數(shù)；相對(duì)生長(zhǎng)速度（%）=處理的生長(zhǎng)速度/CK的生長(zhǎng)速度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3—5次，利用Prism（version 8.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 香菇菌絲生長(zhǎng)的最適pH

利用濃度為1 mol·L-1HCL或NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，分析香菇菌絲生長(zhǎng)的最適 pH，結(jié)果如圖 1所示，香菇菌絲在pH 3.0—7.0的范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，其中pH 4.0時(shí)生長(zhǎng)速度最快；當(dāng)pH＞4.0時(shí)，pH越高，菌絲生長(zhǎng)速度越慢；CK不含HCL或NaOH，pH為5.5，菌絲生長(zhǎng)速度介于pH 5.0和pH 6.0之間。因此，在PDA培養(yǎng)基上，香菇菌絲生長(zhǎng)的最適pH為4.0。

2.2 酸化木屑中主要有機(jī)酸的種類及含量

圖1 不同初始pH對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of different initial pH on mycelial growth rate of L. edodes on PDA media

利用 GC-MS對(duì)酸化木屑和正常木屑中有機(jī)酸進(jìn)行鑒定，樣品中共發(fā)現(xiàn)9種主要有機(jī)酸，其中草酸、苯甲酸和香草酸可能主要是木屑的成分。乙酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和檸檬酸可能不僅是木屑成分，也可能是微生物發(fā)酵代謝的產(chǎn)物[18-19]，針對(duì)這6種有機(jī)酸，利用HPLC檢測(cè)正常木屑和酸化木屑中的含量，結(jié)果表明乙酸、丙二酸、琥珀酸和α-酮戊二酸4種有機(jī)酸在兩種木屑中的含量都非常低，無(wú)明顯差異；乳酸和檸檬酸在兩種木屑中的差異非常大（圖 2），正常木屑中幾乎檢測(cè)不到乳酸和檸檬酸，酸化木屑中乳酸和檸檬酸的含量分別達(dá)到（4.6±0.22）mg·g-1和（23±3.35）mg·g-1（按干重計(jì)算），推測(cè)酸化木屑中的檸檬酸和乳酸主要為堆放過(guò)程中微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生。

正常木屑樣品和酸化木屑樣品的 pH分別為 6.0和3.0。正常木屑的pH主要與樹種有關(guān)，大多數(shù)闊葉樹木材的pH為5.0—7.0[20-22]。木屑露天堆放過(guò)程中，尤其是碳源充足時(shí)，發(fā)酵易產(chǎn)生有機(jī)酸[2]，本研究樣品中檸檬酸含量達(dá)到了23 mg·g-1，足以使pH降至3.0，由此推測(cè)酸化木屑 pH的降低主要是微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生檸檬酸的結(jié)果。

2.3 有機(jī)酸和鈣鹽在 PDA培養(yǎng)基上對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

5 mmol·L-1乳酸對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，25和50 mmol·L-1時(shí)具有不同程度抑制作用；而5、25和 50 mmol·L-1的檸檬酸對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用（圖3）。

碳酸鈣和檸檬酸鈣對(duì)香菇菌絲的抑制作用最強(qiáng)，并且濃度越高，抑制越強(qiáng)；乳酸鈣在5 mmol·L-1時(shí)無(wú)顯著影響，濃度為25和50 mmol·L-1時(shí)對(duì)香菇菌絲具有一定的抑制作用；硫酸鈣對(duì)香菇菌絲無(wú)顯著影響（圖4）。

圖2 酸化木屑中主要有機(jī)酸的種類Fig. 2 Types of main organic acids in acidified wood chips

圖3 不同濃度有機(jī)酸對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effects of different concentration of organic acids on mycelial growth of L. edodes on PDA media

有機(jī)酸和鈣鹽對(duì)香菇菌絲的抑制作用非常復(fù)雜，可能與鈣離子、pH、緩沖作用和酸根離子等多種因素有關(guān)。硫酸鈣對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，說(shuō)明本研究中鈣離子不是影響菌絲生長(zhǎng)的主要原因。有機(jī)酸使培養(yǎng)基pH下降，如添加50 mmol·L-1檸檬酸或50 mmol·L-1乳酸的PDA 培養(yǎng)基pH分別為2.9和3.2，遠(yuǎn)低于最適pH 4.0，菌絲的相對(duì)生長(zhǎng)速度分別為69.1%和60.1%；檸檬酸鈣和碳酸鈣等堿性鈣鹽使培養(yǎng)基pH升高，如添加50 mmol·L-1檸檬酸鈣和碳酸鈣的培養(yǎng)基pH都為7.0，菌絲的相對(duì)生長(zhǎng)速度分別為49.5%和31.7%（圖4），說(shuō)明pH是有機(jī)酸和堿性鈣鹽抑制香菇菌絲的一個(gè)主要原因。pH 7.0時(shí)，碳酸鈣和檸檬酸鈣對(duì)菌絲的抑制作用遠(yuǎn)高于NaOH，由于碳酸鈣和檸檬酸鈣在 pH 6.4左右具有很強(qiáng)的緩沖作用，推測(cè)鈣鹽的抑制作用可能還與緩沖作用有關(guān)。

圖4 不同濃度鈣鹽對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of calcium salt on mycelia growth of L. edodes on PDA media

2.4 PDA培養(yǎng)基的緩沖作用對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響

檸檬酸鈣和碳酸鈣在PDA培養(yǎng)基內(nèi)有沉淀，為了更準(zhǔn)確的檢測(cè)緩沖作用對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響，分別用CBS和PBS調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH。兩種緩沖液的最適pH都是4.0；pH 4.0時(shí)，緩沖液濃度不影響菌絲生長(zhǎng)；pH＞4.0時(shí)，緩沖液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)緩沖能力達(dá)到一定的閾值，能導(dǎo)致菌種完全不萌發(fā)。CBS為25 mmol·L-1時(shí)，菌絲在pH 6.0和pH 7.0的PDA培養(yǎng)基上不能萌發(fā)；50 mmol·L-1時(shí)，菌絲在pH 5.0的PDA培養(yǎng)基上也不能萌發(fā)（圖5）。緩沖液濃度越高，緩沖能力越大，由此可見(jiàn)，當(dāng)偏離最適pH時(shí)，培養(yǎng)基的緩沖作用也是影響菌絲生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。

圖5 緩沖液對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 5 Effect of buffer on mycelial growth of L. edodes on PDA media

2.5 香菇菌絲生長(zhǎng)對(duì)PDA培養(yǎng)基pH的影響

在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，定期檢測(cè)PDA培養(yǎng)基pH的變化，結(jié)果如圖6所示，添加HCL或NaOH的處理，接種前 pH＞4.0，接種后 pH下降，最終降至pH 4.0左右。添加有機(jī)酸的處理，接種前PDA培養(yǎng)基的 pH＜4.0，接種后 pH升高；添加鈣鹽的培養(yǎng)基接種前 pH＞4.0，接種后 pH下降，最終均調(diào)節(jié)至 pH 4.0左右。由此說(shuō)明，香菇菌絲對(duì)環(huán)境pH具有一定的調(diào)節(jié)能力。當(dāng)培養(yǎng)基 pH＞4.0時(shí)，香菇菌絲通過(guò)代謝調(diào)節(jié)基質(zhì)pH，最終將基質(zhì)pH變?yōu)?4.0，以利于菌絲的生長(zhǎng)。如果培養(yǎng)基中含有緩沖系統(tǒng)，阻礙pH的變化，則抑制菌絲的正常生長(zhǎng)。由此可以解釋緩沖液和鈣鹽對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響機(jī)制。

圖6 接種前后PDA培養(yǎng)基pH變化Fig. 6 Changes in pH of PDA media before and after inoculation

3 討論

不同的研究中最適pH并不完全一致，如MARKOVIC等[23]測(cè)定的最適pH為3.0—3.63；AMINUDDIN等[24]測(cè)定的最適pH為6.0；萬(wàn)洪善[25]測(cè)定的最適pH為5.6。造成這種差異的原因除了所用的菌株和方法不同之外，可能還與香菇調(diào)控環(huán)境 pH的能力有關(guān)。本研究表明當(dāng)環(huán)境pH＞4.0時(shí)，香菇菌絲通過(guò)分泌草酸降低pH[11,15]，最終將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至4.0，以滿足生長(zhǎng)需求。當(dāng)環(huán)境pH＜4.0時(shí)，香菇對(duì)pH的影響較小，而污叉絲孔菌（Dichomitus squalens）在低pH條件下，草酸脫羧酶和甲酸脫氫酶等基因的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)降解基質(zhì)中的草酸，提高pH[26-27]。香菇菌棒中pH的變化與本研究在PDA培養(yǎng)基的檢測(cè)結(jié)果一致[6]。不論用HCL-NaOH還是緩沖液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH，初始pH 4.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快；并且當(dāng)pH＞4.0時(shí)，隨著菌絲的生長(zhǎng)，最終pH均為4.0，由此說(shuō)明香菇菌絲生長(zhǎng)的最適pH為4.0。

目前關(guān)于緩沖作用對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道相對(duì)較少，pH＞4.0時(shí)，香菇菌絲產(chǎn)草酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，緩沖作用阻礙了培養(yǎng)基pH的變化，從而增加了 pH對(duì)香菇菌絲生長(zhǎng)的影響。本研究中，當(dāng)緩沖作用達(dá)到一定的閾值，pH 5.0—7.0的范圍內(nèi)，緩沖液可能完全抑制香菇菌絲的生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌種不萌發(fā)。生產(chǎn)中，木屑發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，用石灰調(diào)節(jié)pH時(shí)形成有機(jī)酸鈣，如果鈣鹽在pH 5.0—7.0范圍內(nèi)具有緩沖作用，則可能抑制香菇菌絲的生長(zhǎng)。檸檬酸鈣和碳酸鈣在 pH 6.4左右具有較強(qiáng)的緩沖作用，在PDA培養(yǎng)基上能顯著抑制香菇菌絲的生長(zhǎng)；乳酸的pKa=3.86，乳酸鈣在pH 5.0—7.0范圍內(nèi)的緩沖作用較弱，其在PDA培養(yǎng)基上的抑制作用也相對(duì)較弱。由此可見(jiàn)，生產(chǎn)中調(diào)節(jié)培養(yǎng)料的 pH時(shí)，不僅要考慮pH，還要考慮培養(yǎng)料內(nèi)各種成分的緩沖作用。

有機(jī)酸對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的影響。檸檬酸能促進(jìn)杏鮑菇（P. eryngii）、金針菇、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）和黑柄炭角菌（Xylaria nigripes）的菌絲生長(zhǎng)[28-31]；乳酸能抑制杏鮑菇和平菇菌絲生長(zhǎng)[17]。本研究中，除5 mmol·L-1的乳酸輕微促進(jìn)香菇菌絲生長(zhǎng)外，其他濃度的乳酸和檸檬酸均抑制香菇菌絲生長(zhǎng)。有機(jī)酸的影響機(jī)制可能與 pH和有機(jī)酸根離子兩個(gè)方面有關(guān)，檸檬酸和檸檬酸鈣對(duì)香菇菌絲都有抑制作用，pH 4.0時(shí)，50 mmol·L-1的檸檬酸緩沖液不影響菌絲生長(zhǎng)，說(shuō)明本研究中檸檬酸根離子不是影響香菇菌絲生長(zhǎng)的主要原因，檸檬酸對(duì)香菇菌絲的抑制作用主要與pH有關(guān)。

4 結(jié)論

香菇菌絲能夠在pH 3.0—7.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適pH為4.0。當(dāng)pH＞4.0時(shí)，香菇菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)代謝降低環(huán)境pH，如果培養(yǎng)基中含有阻礙pH調(diào)節(jié)的緩沖系統(tǒng)，則抑制香菇菌絲的生長(zhǎng)；當(dāng)緩沖能力達(dá)到一定的閾值，可導(dǎo)致菌種完全不萌發(fā)。