1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期間品質和軟化相關基因表達的影響

程玉豆，張亞光，關軍鋒，馮云霄，何近剛

（河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所/河北省植物轉基因中心，石家莊 050051）

0 引言

【研究意義】近年來，西洋梨在我國市場上日益受到歡迎，其中，‘早紅考密斯’梨為代表性品種。它原產(chǎn)于英國，屬于早熟品種，果實呈葫蘆狀，果皮呈紫紅色，果面平滑有光澤，果肉白色，具有肉質細膩、柔軟多汁、風味香甜的特點，果實品質上乘[1]。但因其果實采后易軟化和腐爛，貨架期較短，無法滿足廣大消費者的需求，因此，常需要冷藏來延長供應時間。果實受采后處理、周轉與運輸?shù)纫蛩氐挠绊?，常常會導致果實品質劣變，降低商品價值，損耗嚴重[2]。因此，探究‘早紅考密斯’梨采后冷藏和貨架期品質變化規(guī)律及其相關調控機理，對果實采后貯藏保鮮新技術的研發(fā)具有重要指導意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，在一些蘋果和西洋梨品種上，適當推遲冷藏能減少果實冷害，改善品質[3-5]，但在部分白梨、獼猴桃和李子等水果中，延遲冷藏則會加重組織褐變[6-8]。1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP），可以與乙烯競爭結合受體，從而抑制乙烯介導的果實后熟相關生理生化反應。因此，1-MCP作為一種新型保鮮劑，在果蔬貯藏保鮮領域得到了廣泛應用[9-10]，如 1-MCP處理可有效抑制常溫貨架期間果肉軟化、腐爛，維持果實品質[11-13]；1-MCP可減少果實冷藏及后續(xù)貨架期間虎皮病、黑心病的發(fā)生[14-17]。綜上所述，1-MCP在延長果實貯藏和貨架期中的作用及其機制值得重視。軟化是引起果實衰老的重要因素，已有研究表明，果實軟化與多聚半乳糖醛酸酶（PG）、α-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-ARF）和β-半乳糖苷酶（β-GAL）等細胞壁水解酶活性及其編碼基因表達量上調密切相關[18-23]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理可以有效降低果實PG、α-ARF和β-GAL等酶活性及其編碼基因表達，進而延緩果實軟化[22-23]。【本研究切入點】盡管延遲冷藏和1-MCP處理在多種果實貯藏中得到研究，但不同品種間的效果存在差異[3-8]，并且，在‘早紅考密斯’梨上，延遲冷藏的效果如何，目前還不清楚，有關1-MCP保鮮效果及其具體調控機制也缺乏系統(tǒng)研究。【擬解決的關鍵問題】通過研究1-MCP和延遲冷藏處理對‘早紅考密斯’梨貨架期間品質和軟化的影響，解析‘早紅考密斯’梨中果實軟化相關基因表達模式，為延長‘早紅考密斯’梨貯藏及貨架期提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試‘早紅考密斯’梨（Pyrus communisL. cv.‘Doyenne du Comice’）于2018年7月22日采收自河北省深州市唐奉鎮(zhèn)東蒲疃村果園（北緯 N 38°08′15.03″，東經(jīng) E 115°34′31.34″），采收當天運回實驗室。選取大小適中、成熟度相對一致、無機械損傷和病蟲害的果實并平均分成2組。室溫（20±2）℃下，一組進行1-MCP（有效成分0.14%，美國陶氏公司生產(chǎn)）密封熏蒸處理24 h（最終濃度為1.0 μL·L-1）；另一組以空氣密封24 h作為對照，每組處理360個果實。結束后取出2組果實，再分別進行如下處理：（1）直接進行（0±0.5）℃冷藏；（2）（20±2）℃下放置3 d后再進行（0±0.5）℃冷藏（記作20℃ 3 d）；（3）（20±2）℃下放置6 d后再進行（0±0.5）℃冷藏（記作20℃ 6 d）?？諝饷芊夂?-MCP熏蒸處理后直接進行（0±0.5）℃冷藏果實分別記做：CK和1-MCP；處理后20℃下放置3 d后再進行0℃冷藏果實分別記做：20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 3 d；（20±2）℃下放置6 d后再進行（0±0.5）℃冷藏果實分別記做：20℃ 6 d和1-MCP+20℃ 6 d，每個處理設置3個重復，每個重復40個果實。以直接進行（0±0.5）℃冷藏計，果實貯藏95 d后取出，置于（20±2）℃下貨架貯存，分別測定其0、3和6 d品質指標（硬度、可溶性固形物、可滴定酸含量）。同時，取果肉樣品經(jīng)液氮冷凍后于-80℃凍存，備用。

1.2 品質與腐爛率測定

硬度：將果實去皮后，采用GY-4型果實硬度計（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司）測定?？扇苄怨绦挝锖浚⊿SC）：采用PAL-1型手持數(shù)字糖度計（日本ATGAO公司）測定。可滴定酸（TA）含量：采用酸堿滴定法測定。每個處理重復3次，每次重復5個果實。腐爛率：統(tǒng)計腐爛的果實數(shù)，腐爛率計算公式如下：腐爛率（%）=（腐爛果數(shù)/總果數(shù)）×100。

1.3 呼吸速率和乙烯釋放速率測定

將果實放在氣密性良好的真空干燥器中密封 3 h后，采用HWF-1 CO2紅外分析儀（江蘇金壇市科析儀器有限公司）測定 CO2含量，計算呼吸速率。采用GC9790ⅡB型氣相色譜儀（浙江福立分析儀器股份有限公司）測定乙烯含量，計算乙烯釋放速率。色譜條件：載氣為氮氣，進樣量1 mL。測定條件為：柱箱溫度90℃，汽化室溫度140℃，F(xiàn)ID溫度200℃；氮氣流量 30 mL·min-1，氫氣流量 30 mL·min-1，空氣流量300 mL·min-1。每個處理重復3次，每次重復10個果實。

1.4 RNA提取與定量分析

RNA提取采用改良 CTAB法[24]；反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）和熒光定量試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTMII）均購自寶生物工程（大連）有限公司。定量分析采用ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），反應體系：10.0 μL SYBR Green PCR Premix Ex Taq?，0.5 μL ROX Reference DyeⅡ，正、反向引物（10 μmol·L）各 0.5 μL，5 ng cDNA 模板，6.0 μL ddH2O。反應條件：95℃預變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。反應結束后做熔解曲線確定目的基因片段的特異性。以ACT2為內(nèi)參基因，采用2-ΔCT法計算目標基因表達量，PG1、PG2、ARF1、ARF2和GAL4定量分析引物參考WEI等[22]文獻報道，具體如表1所示。

表1 果實軟化相關基因qRT-PCR引物Table 1 Primers of the fruit softening-related gene for qRT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 18.0軟件進行作圖和統(tǒng)計分析，方差分析采用Duncan法，結果用3次重復的平均值表示。

2 結果

2.1 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨冷藏后腐爛的影響

由表2可知，出庫當天（貨架0 d）時，空氣密封處理后再延遲3 d（20℃ 3 d）和6 d（20℃ 6 d）冷藏的果實明顯加劇腐爛，分別是空氣密閉處理后（0±0.5）℃直接冷藏果實（CK）的3.8和10.4倍，說明在不進行 1-MCP處理時，延遲冷藏明顯不利于果實貯藏保鮮；相反，1-MCP處理可明顯降低‘早紅考密斯’梨出庫時腐爛率，盡管1-MCP處理果實在延遲冷藏后也加劇果實腐爛，但與20℃ 3 d和20℃ 6 d處理相比，果實腐爛明顯減少，在生產(chǎn)上具有實際意義?？傮w來說，保鮮效果最好的是 1-MCP處理后再（0±0.5）℃直接冷藏處理（1-MCP）果實。20℃ 3 d和20℃ 6 d處理果實由于腐爛嚴重，無法再進行后續(xù)研究。其他處理在貨架6 d內(nèi)均未出現(xiàn)腐爛，可用于后續(xù)研究。

2.2 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期品質的影響

隨著貨架期延長，各處理間果實硬度均呈下降趨勢，并且延遲冷藏會加速果實軟化；與CK相比，‘早紅考密斯’梨經(jīng)1-MCP處理后，果實具有較高的硬度，直接冷藏處理的果實硬度最高，1-MCP處理后延遲6 d冷藏（1-MCP+20℃ 6 d）果實硬度下降程度最大，1-MCP處理后延遲3 d冷藏（1-MCP+20℃ 3 d）果實硬度介于二者之間（圖1-A）。SSC在處理與對照果實間差異較小，除貨架3 d時，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d處理果實SSC顯著高于CK外，其他貨架時間各處理則無顯著差異（圖1-B）；TA含量在各處理果實中均呈緩慢下降趨勢，其中，1-MCP處理果實在貨架3 d時顯著高于CK，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d處理果實在貨架6 d時顯著高于CK（圖 1-C）。說明 1-MCP能明顯延緩‘早紅考密斯’梨果肉的軟化速度，1-MCP結合延遲冷藏后有一定的促進軟化作用，并能保持較好的風味。

2.3 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨冷藏后貨架期呼吸速率和乙烯生成速率的影響

‘早紅考密斯’梨在冷藏后貨架0 d時，1-MCP結合延遲冷藏處理果實呼吸速率顯著低于CK；隨著貨架期延長，CK果實呼吸速率迅速上升，1-MCP結合延遲冷藏處理果實呼吸速率上升則較緩慢。在貨架6 d時，1-MCP+20℃ 3 d和1-MCP+20℃ 6 d處理果實呼吸速率有所下降（圖2-A）。貨架0 d時，CK果實的乙烯釋放速率最高，隨著貨架時間延長，乙烯釋放速率大幅降低；與CK相比，1-MCP結合延遲冷藏處理果實乙烯釋放速率變化不明顯，在貨架0 d和3 d時低于對照，但在6 d時與對照接近（圖2-B）。

表2 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨果實腐爛的影響Table 2 Effect of 1-MCP and delayed cold-storage on the decay of 'Doyenne du Comice' pear fruit

圖1 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期硬度（A）、可溶性固形物（B）和可滴定酸含量（C）的影響Fig. 1 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the firmness (A), SSC (B) and TA content (C) of 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.4 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨冷藏后貨架期PGs表達的影響

圖2 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期呼吸速率（A）和乙烯釋放速率（B）的影響Fig. 2 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the rates of respiration (A) and ethylene production (B) of'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

實時熒光定量PCR分析結果顯示，CK果實中，PG1表達呈先上升后下降趨勢，在貨架期3 d時表達量最高；而1-MCP結合延遲冷藏處理果實中PG1表達量則呈持續(xù)增加趨勢，但在貨架期0 d和3 d時，PG1表達量顯著低于CK；貨架6 d時，1-MCP+20℃ 3 d和 1-MCP+20℃ 6 d處理果實中PG1表達量高于CK，并以1-MCP+20℃ 6 d處理的PG1表達量最高（圖3-A）。與PG1相似，CK果實中，PG2表達模式也呈先上升后下降趨勢。1-MCP結合延遲冷藏處理果實在貨架期0 d時，PG2表達量顯著低于CK，然后逐漸升高；貨架3 d時，1-MCP+20℃ 6 d處理果實中PG2表達量開始顯著高于CK；貨架6 d時，1-MCP結合延遲冷藏處理果實中PG2表達量均顯著高于CK，并表現(xiàn)為1-MCP+20℃ 3 d處理的最高，1-MCP+ 20℃ 6 d處理的次之，1-MCP處理最低（圖3-B）。

圖3 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期PGs表達的影響Fig. 3 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of PGs in the 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.5 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨冷藏后貨架期ARFs表達的影響

ARF1在 CK果實中同樣呈現(xiàn)先緩慢上升再下降的趨勢，并且，1-MCP結合延遲冷藏處理果實中ARF1表達量在整個貨架期均顯著低于CK；在貨架3 d時，1-MCP+20℃ 6 d處理果實ARF1表達量顯著高于1-MCP和1-MCP+20℃3 d處理果實，而在貨架6 d時，1-MCP+20℃ 3 d處理果實ARF1表達量則顯著高于1-MCP和1-MCP+20℃ 6 d處理果實（圖4-A）。與ARF1表達模式不同，ARF2在所有處理中均表現(xiàn)出隨著貨架時間延長而表達量逐漸下降的趨勢，與CK相比，1-MCP結合延遲冷藏處理顯著抑制了貨架期間ARF2表達；并且，在貨架0 d和3 d時，1-MCP處理果實ARF2表達量均為最低（圖4-B）。

圖4 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期ARFs表達的影響Fig. 4 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of ARFs (A and B) in the 'Doyenne du Comice' pear during shelf-life

2.6 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨冷藏后貨架期GAL4表達的影響

在1-MCP結合延遲冷藏處理的果實中，GAL4表達量在貨架期間均顯著低于CK果實，并且貨架0 d和3 d時，GAL4表達量表現(xiàn)為1-MCP+20℃ 6 d處理的最高，1-MCP+20℃ 3 d處理的次之，1-MCP處理最低；而在貨架6 d時，1-MCP+20℃ 6 d處理果實的GAL4表達量則顯著高于1-MCP和1-MCP+20℃ 3 d處理的果實（圖5）。

3 討論

圖5 1-MCP和延遲冷藏對‘早紅考密斯’梨貨架期 GAL4基因表達的影響Fig. 5 Effects of 1-MCP and delayed cold-storage treatments on the expression of GAL4 in the 'Doyenne du Comice'pear during shelf-life

乙烯在調控呼吸躍變型果實成熟衰老過程中發(fā)揮著重要的作用[25]。本研究中，1-MCP處理可顯著抑制‘早紅考密斯’梨果實冷藏后貨架期呼吸速率和乙烯釋放速率，這與其抑制梨果實乙烯合成酶活性及相關基因表達有直接關系[26-27]，表明 1-MCP可通過降低‘早紅考密斯’梨內(nèi)源乙烯合成延緩果實成熟衰老。西洋梨果肉軟化是其成熟衰老的重要指標之一。研究表明，一些西洋梨品種如‘巴梨’‘安久’‘阿巴特’和‘康復倫斯’梨等使用1-MCP處理后，貯藏和貨架期果肉軟化減緩，果實腐爛和虎皮病減少[27-31]。與上述研究結果相似，本研究中，1-MCP處理也可有效延遲果實冷藏后貨架期硬度下降，減少果實腐爛，因此，1-MCP處理有利于‘早紅考密斯’梨采后貯藏保鮮。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著延遲冷藏時間延長，‘早紅考密斯’梨果實腐爛率明顯加劇，但經(jīng)1-MCP處理可明顯減少腐爛，與此同時，1-MCP結合延遲冷藏處理的果實在貨架期硬度下降速度相對較快，因此，從西洋梨自身品種特性——需后熟軟化的意義上來講，對于1-MCP處理過的果實，可適當延長常溫下運輸或周轉時間。如果單純?yōu)榱藴p少腐爛，在‘早紅考密斯’梨采后貯藏中，無論是否使用1-MCP處理，果實采收后應盡快入冷庫貯藏。

果實軟化過程主要由細胞壁結構破壞及果膠物質降解引起，其中以PG研究最為深入。研究表明，PG參與了梨果實采后軟化過程[22-23,32]。在‘南果’梨中，PuPG1、PuPG4和PuPG7在采收后的果實中開始表達，且隨著貯藏時間的延長，表達量逐漸升高，1-MCP處理明顯抑制3個基因的表達[33]。‘京白’梨中，PG1和PG2隨著硬度下降表達量迅速升高，1-MCP處理在顯著抑制果實乙烯生成和硬度下降的同時，極顯著抑制了PG1和PG2表達量升高[18]。本研究結果與‘南果’和‘京白’梨中的報道相似，即貨架期果實軟化越快，PG1和PG2表達量在軟化前期就越高，反之亦然，這說明PG1和PG2因參與了‘早紅考密斯’冷藏后貨架期果實軟化過程。相比于PG1，各處理果實中PG2在貨架期0 d時稍低，但在后續(xù)貨架期變化幅度較PG1大，推測PG1和PG2在‘早紅考密斯’梨冷藏后貨架期果實軟化過程的作用可能略有不同，PG1可能在果實軟化前期起主要作用，而PG2則可能在果實軟化中期起主要作用。

α-ARF和β-GAL與果實成熟時細胞壁的修飾過程密切相關，α-ARF可以通過水解果膠上的阿拉伯糖苷鍵而引起細胞壁完整性遭到破壞；而β-GAL則通過降解果膠多聚醛酸鏈上的半乳糖苷鍵使細胞壁變得膨脹而不穩(wěn)定，這兩種酶活性及其基因表達量升高均可導致果實軟化[21,34-35]。本研究中，ARF1表達量高，果實硬度下降迅速，并且1-MCP處理抑制了ARF1的表達，硬度下降緩慢，這與‘京白’梨常溫貯藏中的研究結果相似[22]，表明ARF1參與了‘早紅考密斯’梨貨架期果實軟化過程，1-MCP通過抑制其表達延遲果實軟化進程，達到果實保鮮效果。ARF2由于在各處理中隨著貨架期延長表現(xiàn)出表達量逐漸下降，與果實硬度下降的趨勢不同，因此，推測其可能不參與‘早紅考密斯’梨貨架期軟化過程。已有研究證實，西洋梨中GAL1/2在果實軟化前期表達量迅速升高，并受1-MCP處理抑制[21]；在日本梨中，JP-GAL只在成熟果實中表達，并且與果實軟化密切相關[35]；‘京白’梨采后貨架期間GAL4表達量伴隨著果實硬度下降而逐漸升高，1-MCP處理可以顯著抑制其表達和硬度下降[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，GAL4表達模式也與果實軟化密切相關，即在果實硬度下較降快的處理中，GAL4表達量高；果實硬度下降緩慢的處理中，GAL4表達量相對較低，結合日本梨和‘京白’梨的研究結果，說明GAL4參與了‘早紅考密斯’梨果實貨架期軟化過程，1-MCP可以通過抑制GAL4表達延遲果實貨架期軟化進程。

4 結論

‘早紅考密斯’梨延遲冷藏易導致果實貯藏期軟化速度加快，果實腐爛嚴重，建議采收后盡快入庫冷藏。1-MCP處理能夠有效延遲‘早紅考密斯’梨貨架期果實硬度下降，抑制果實呼吸和內(nèi)源乙烯生成，減少果實腐爛，保持果實品質，起到了很好的保鮮作用。與1-MCP處理后直接冷藏相比，1-MCP結合延遲冷藏6 d處理可一定程度促進貨架期果實軟化。1-MCP通過抑制軟化相關基因PG1、PG2、ARF1和GAL4等的表達，維持‘早紅考密斯’梨貨架期果實硬度，達到保鮮效果。