棉花黃萎病菌致病力分化及遺傳多樣性研究進(jìn)展

趙曾強(qiáng)，孫國清，2，呂 寧，孔 新，謝宗銘，李全勝，張國麗

（1新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點實驗室，新疆 石河子 832003；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

0 引言

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahli?aeKleb.）引起的土傳性維管束病害，該病原菌遺傳多樣性豐富[1]，寄主范圍廣，存活力強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙該病害發(fā)生和防治的研究進(jìn)展，且目前并沒有有效的防治措施。不同生態(tài)條件下，特別是寄主和地區(qū)不同時，V.dahliae致病性變化很大[2，3]，其群體結(jié)構(gòu)組成與變化直接影響著病害的發(fā)生與流行。近年來不同學(xué)者對棉花黃萎病菌的多樣性進(jìn)行了一些研究，但該群體結(jié)構(gòu)一直處于動態(tài)變化之中，菌株變異頻繁，強(qiáng)致病力菌株擴(kuò)展迅速。因此，本文對棉花黃萎病菌遺傳多樣性及致病力分化進(jìn)行綜述，以期為棉花黃萎病菌的研究工作提供參考。

棉花黃萎病一般現(xiàn)蕾后開始發(fā)病，田間表現(xiàn)最多的為普通型，葉肉間出現(xiàn)不規(guī)則嵌狀病斑，主脈仍保持綠色，呈掌狀斑駁（“花西瓜皮”狀）。有時夏季暴雨過后或澆水過后也會出現(xiàn)急性青萎型，多數(shù)或全株葉片萎蔫下垂，病葉似開水燙傷狀萎蔫，并很快脫落呈光稈。秋季重病株下部葉片脫落，僅在頂端殘留少量小葉或又發(fā)出新葉，蕾鈴稀少，嚴(yán)重影響棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量[4，5]。

1 V.dahliae致病力及致病類型的分化

V.dahliae變異速度快、寄主范圍廣、品種抗性不一及生態(tài)環(huán)境的差異等，造成病原菌在形態(tài)、致病力等方面的分化。

根據(jù)培養(yǎng)特性，可將V.dahliae分為菌絲型、菌核型和中間型，且菌落類型與致病力具有一定的相關(guān)性，一般中間型致病力較弱或中等，菌核型致病力較強(qiáng)[6]。然而宋曉軒[7]在河南安陽發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重落葉癥狀的菌系中存在菌絲型，其致病力是菌核型的兩倍左右。韓宏偉等[8]對新疆不同地區(qū)的72個菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及致病性測定，其中菌絲型菌株共14株，弱致病力菌株5株，中等致病力6株，強(qiáng)致病力3株。因此菌絲型菌株也可能存在強(qiáng)、中、弱致病力的分化，還有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)癥狀可分為普通型、落葉型和枯死型。Schnathorst 和Mathre[9]首次根據(jù)V.dahliae在棉花上的致病力不同，將其分為落葉型（Defoliating，D）和非落葉型（Non-Defoliating，ND）兩個類群。但僅憑癥狀不能確定病原菌是落葉型還是非落葉型菌系，這還與感病早晚及品種抗病性有密切關(guān)系。Pérez-Artés[10]設(shè)計特異性引物D1/D2 和ND1/ND2，可以從分子上將兩種致病菌類型區(qū)別開來。新疆在1999年以前沒有發(fā)現(xiàn)落葉型菌株[11]，且致病力普遍較弱；到2004年時發(fā)現(xiàn)有少量落葉型菌株[12]；到2008年檢測時發(fā)現(xiàn)，落葉型菌株已占到待測菌株的40%[13]。說明棉花黃萎病菌群體結(jié)構(gòu)一直處于動態(tài)變化之中，菌株變異頻繁，強(qiáng)致病力菌株擴(kuò)展迅速。

2 V.dahliae生理小種的劃分

Bredikhina[14]首次將蘇聯(lián)棉花上的V.dahliae分為0、1、2 三個生理小種（表1）。其后，попов，якутиб，касьчненко 等[15]共鑒定出V. dahliae的8 個生理小種：0號小種V1V2V3，1號小種V1+V2V3+，2號小種V1V2+V3+，3號小種V1+V2+V3+，4號小種V1V2V3+，5號小種V1+V2V3+，6號小種V1V2+V3，7號小種V1+V2+V3（V+為毒性基因，V 為無毒性基因）。我國學(xué)者根據(jù)10個菌系在海島棉、陸地棉和中棉三大棉種9 個棉花品種上的致病力不同，可將其劃分為三個生理型[6]，但沒有明確的生理小種劃分：生理型I，致病力最強(qiáng)，陜西涇陽菌系為代表，對三大棉種都有嚴(yán)重感染；生理型II，致病力最弱，如新疆和田及車排子菌系，對三大棉種感染都很輕，但根據(jù)近年來的研究[11-13，16]和調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆棉區(qū)強(qiáng)致病力菌株擴(kuò)展迅速，截止2008 年時，中強(qiáng)以上致病力菌株已占待測菌株的80%以上；生理型III，致病力中等，如河南安陽、河北欒城和永年、遼寧遼陽、江蘇豐縣、四川南部和云南賓川等菌系。由于V.dahliae變異速度快、各地使用的鑒別寄主不一等原因，目前沒有統(tǒng)一的劃分標(biāo)準(zhǔn)。

另一種致病性分化（Pathogenic variation）的劃分方法是將來源不同的V.dahliae群體分為兩個生理小種，由效應(yīng)基因Ave1的存在與否決定。Ave1對含有抗病基因Ve1的番茄或含有與Ve1同源抗病基因Vr1的萵苣是無毒的[17，18]。這些抗性基因在很多植物包括一些茄科植物中是保守的，生理小種1 侵染含有抗性基因Ve1或Ve1同源基因的植物，植物編碼模式識別受體識別到小種1的毒性基因Ave1的編碼產(chǎn)物就會觸發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)；相應(yīng)地，缺乏Ve1抗性基因的番茄和擬南芥則對生理小種1 表現(xiàn)高度感病[19]。相反，生理小種2則不含效應(yīng)基因Ave1，因此含有抗性基因的Ve1植物對其也表現(xiàn)感病[20，21]。生理小種2寄主范圍廣，遺傳多樣性豐富，在世界范圍內(nèi)廣泛存在[22]。研究者利用引物對Tr1/Tr2和VdR2F/VdR2R可將來源不同的V. dahliae分為兩個生理小種，其中檢測的100 株來源于棉花上的菌株屬于生理小種2[22]。

表1 前蘇聯(lián)棉花黃萎病生理小種劃分[14]Table1 Cotton Verticillium wilt physiological division in Soviet Union[14]

3 營養(yǎng)親和群研究

營養(yǎng)親和群（Vegetative Compatibility Group，VCG）是指兩菌株交融合并交換細(xì)胞質(zhì)的遺傳能力，傳統(tǒng)上主要利用VCG 分析V. dahliae遺傳多樣性。Puhalla[23]首次利用nit 突變體技術(shù)對V.dahliae進(jìn)行營養(yǎng)親和型研究，將其劃分為16 個營養(yǎng)體親和群（VCGs）。隨后Joaquim等[24]采用不能以硝酸鈉為唯一氮源正常生長的nit 突變體親和技術(shù)，將Puhalla所劃分的16個VCGs重新劃分成4個。利用VCG技術(shù)可將不同寄主和地理來源不同的V.dahliae分為5個 營 養(yǎng) 親 和 群（VCG1，VCG2，VCG3，VCG4 和VCG6），后來又根據(jù)菌株互補(bǔ)的活力和頻率分為不同的亞群（VCG1A 和VCG1B，VCG2A 和VCG2B，VCG4A和VCG2B）[24]。落葉型和非落葉型菌株屬于不同的VCGs 類群，棉花黃萎病落葉型菌株屬于VCG1A，非落葉型菌株在VCG2A 和VCG4B 都有存在[25]，VCG類群與致病力具有一定的相關(guān)性。

我國學(xué)者也對棉花黃萎病菌營養(yǎng)親和群進(jìn)行了大量研究。李延軍等[26]利用nit 突變體技術(shù)首次對來自我國15個省（市）的66個分離菌株進(jìn)行親和性研究，將這些菌株分為兩個類群，落葉型和非落葉型分別屬于不同的類群。顧本康等[27]對江蘇不同年代的100 個菌株進(jìn)行親和性測定，發(fā)現(xiàn)有6 株能與來自美國的落葉型T9產(chǎn)生親和反應(yīng)，屬落葉型，其余均為非落葉型。吳獻(xiàn)忠等[28]利用VD8、T9和Pu?halla的標(biāo)準(zhǔn)菌系做對照，對山東的代表菌株進(jìn)行營養(yǎng)親和性研究，將VD8、SD13、Puhalla的標(biāo)準(zhǔn)菌系和T9劃分為一個親和群，其他為另一親和群。王克榮等[29]將來自全國不同年代的213 個供試菌株，劃分為5個營養(yǎng)親和群，其中Ⅰ群為落葉型，80年代保存的45 個菌株，只有2 個屬落葉型菌系，而1997 年以后采集的168 個菌株中有163 個菌株為Ⅰ群，劃在落葉型菌系內(nèi)，表明落葉型菌株在江蘇和黃河流域普遍存在。2000年時霍向東等[11]對來自新疆主要植棉區(qū)的30 個棉花黃萎病菌株和4 個對照標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了致病性分化和營養(yǎng)親和性研究，可將測定的34 個菌株分為兩個類群，在新疆沒有發(fā)現(xiàn)落葉型菌株。

4 分子生物學(xué)技術(shù)

V.dahliae的VCG 親和群在群體遺傳結(jié)構(gòu)中可以代表一個獨立的遺傳群體，在分子水平上，不同的VCG 具有明顯的DNA 多態(tài)性，在同一VCG 親和群中也存在遺傳多樣性[30]。因此利用分子生物學(xué)技術(shù)能揭示更多的V.dahliae遺傳多樣性。限制酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增片段多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復(fù)序列（SSR）及簡單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（ISSR）等分子標(biāo)記技術(shù)被用于鑒定病原種群的遺傳多樣性，研究病原種群的演變及種群基因水平轉(zhuǎn)移等[31]。利用AFLP、RFLP 技術(shù)分析V. dahliae遺傳多樣性，聚類發(fā)現(xiàn)與VCG 亞群具高度的相關(guān)性[32]，無關(guān)地理和寄主來源，與致病力強(qiáng)弱也有一定的相關(guān)性，但RAPD有時會產(chǎn)生相反的結(jié)果[33]。例如，朱友勇、馬峙英等[34，35]利用RAPD 技術(shù)對棉花黃萎病菌菌株進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)聚類類群與致病群相關(guān)性不大，與地理來源有一定的相關(guān)性。

朱荷琴等[36，37]對我國不同省市的167 個黃萎病菌菌株進(jìn)行致病力測定及基于SSR 和ISSR 的遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示SSR 聚類類群與菌株的致病力強(qiáng)弱沒有相關(guān)性，與地理來源具有一定的相關(guān)性，而ISSR分析聚類類群與菌株的致病力存在明顯的相關(guān)性，新疆菌系與內(nèi)地菌系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；可將菌株分為強(qiáng)、中、弱3 個致病類型，新疆菌株為弱致病力菌株。毛嵐等[15]對我國20 個省市的棉花黃萎病病菌進(jìn)行ISSR指紋圖譜和營養(yǎng)親和性鑒定，結(jié)果表明可將60 個供試菌株分為兩個遺傳群體和三個營養(yǎng)親和型，遺傳群體和地理來源具有一定的相關(guān)性，三個營養(yǎng)親和型類群和致病力具有一定的相關(guān)性。ISSR可以揭示比RFLP，RAPD，SSR更多的多態(tài)性，操作簡單，特異性強(qiáng)，實驗穩(wěn)定性較高。

5 存在的問題及展望

了解病原菌遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)組成、致病類型分化及分布情況是防治該病害的關(guān)鍵，是病害風(fēng)險評估的前提，對指導(dǎo)抗病育種工作及合理布局抗病品種具有重要意義。V.dahliae寄主范圍廣、變異速度快及生態(tài)環(huán)境的差異等，造成病原菌在形態(tài)、致病力等方面的分化。但陸地棉抗病品種缺乏，且使用的鑒定品種不一等，使得棉花黃萎病菌仍然沒有統(tǒng)一的生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)日新月異，充分利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究V.dahliae遺傳多樣性及致病力分化，掌握病原菌種群群內(nèi)基因變異程度，對棉花黃萎病菌種類鑒定、提高統(tǒng)防統(tǒng)治水平及現(xiàn)代分子育種具有重要意義。