應(yīng)激大鼠髁突軟骨細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)水平變化

王曉菲

顳 頜 關(guān) 節(jié) 病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一種常見病和多發(fā)病。對(duì)其發(fā)病機(jī)制迄今尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。近年來，有關(guān)顳頜關(guān)節(jié)病的機(jī)理和治療一直困擾著國(guó)內(nèi)外學(xué)者，尤其是精神應(yīng)激方面，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步探討精神影響與TMD的關(guān)系，筆者通過動(dòng)物模型，應(yīng)用組織形態(tài)學(xué)方法，觀察心理刺激不同時(shí)期對(duì)相關(guān)炎性因子TNF-α的表達(dá)，以探討精神心理因素在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一級(jí)，75只，體重（150±10）g，雄性，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備 隨機(jī)應(yīng)激儀，自制，裝置分為兩部分即刺激儀和刺激籠。刺激儀在結(jié)構(gòu)上由隨機(jī)發(fā)生器和輸出電路組成。隨機(jī)發(fā)生器由2個(gè)震蕩器形成隨機(jī)組合的脈沖，經(jīng)延時(shí)后控制連續(xù)波發(fā)生器，后者產(chǎn)生4 Hz的連續(xù)頻率，它的持續(xù)時(shí)間即刺激時(shí)間可在2、5、10 s內(nèi)選擇，隨機(jī)形成的連續(xù)波經(jīng)輸出電路輸出，輸出脈沖的空載幅度為150 V。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和方法 將75只大鼠分為空白對(duì)照組、電擊組（foot-shocked，F(xiàn)S）、應(yīng)激組（emotional stress，ES）、藥物對(duì)照組（anti-anxiety-drug，AAD）、生理鹽水組（saline injection，SI），15只/組。 以上各組又隨機(jī)分為10、20、30 d三個(gè)亞組，5只/組。

1.4 建立模型 模型建立時(shí)參考文獻(xiàn)[1，2]的建模方法。電擊組：每天固定時(shí)間給予足部電擊30min，1次/d，電壓80 V，應(yīng)激頻率4 Hz，以維持受刺激動(dòng)物驚恐、緊張和憤怒的應(yīng)激狀態(tài)。應(yīng)激組：電擊組受電擊后排便，豎毛，尖叫等反應(yīng)影響該組大鼠。藥物對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)前30 min給抗焦慮抑郁注射液1 mg/kg體重，與心理對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行。生理鹽水組：實(shí)驗(yàn)前30 min給予同藥物組劑量的鹽水注射?？瞻讓?duì)照組：不給予以上應(yīng)激影響。

各組大鼠的體重、性別通過均衡檢驗(yàn)，證實(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組大鼠均為普通固體飼料，自由飲水，同等飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前1周，將大鼠放入交流箱中適應(yīng)1周，不給予應(yīng)激。應(yīng)激時(shí)間設(shè)置為10 d組、20 d組和30 d組。其中電擊組大鼠僅作為應(yīng)激源，不參與實(shí)驗(yàn)測(cè)試。藥物對(duì)照組、生理鹽水組與應(yīng)激組大鼠一樣，同期、同樣的條件下開始實(shí)驗(yàn)，但這兩組大鼠在實(shí)驗(yàn)前30 min分別皮下注射抗焦慮抑郁藥和生理鹽水。每天上午的固定時(shí)間給予應(yīng)激，以嚴(yán)格對(duì)照，保證研究結(jié)論的可靠性。

1.5 軟骨細(xì)胞的分離 直視下切取髁突軟骨層，放入盛有無鈣平衡鹽液（D-Hanks液）的平皿中，眼科剪盡量剪碎，移入離心管內(nèi)10倍量胰蛋白酶37℃振蕩，消化30 min，0.2%膠原酶Ⅱ37℃振蕩下消化2 h，10 ml混合培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，抗壞血酸50 U/ml）培養(yǎng)于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后首次換液，以后隔天換液。透明軟骨細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2遍，0.5%胰蛋白酶約10 ml消化5 min，DMEM混合培養(yǎng)基反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，消化傳代至平底24孔培養(yǎng)板，每孔種植細(xì)胞數(shù)約5×10 G個(gè)。

1.6 大鼠髁突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物上清TNF-α含量測(cè)定 嚴(yán)格按Promage公司試劑盒使用說明書操作，以ELISA法定量測(cè)定。

1.7 總RNA提取 PBS0.01%mol/L，沖洗離心后加Catrimox-14AM 等量簡(jiǎn)單地粉碎細(xì)胞，Gene Quaant-proRNA/DNA定量RNA最后溶于RNA緩沖液中，吸取5 μlRNA樣品在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為37℃水浴5 min，37℃水浴60 min及70 min加熱10 min；PCR反應(yīng)體系為50 μl，擴(kuò)增條件為:變性94℃ 30 s，復(fù)性50℃40 s延伸72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察攝片。

1.8 髁突軟骨細(xì)胞分離純化 按常規(guī)方法以髁突軟骨細(xì)胞分離液分離靜脈血髁突軟骨細(xì)胞PBMC[3]，采用異硫氰酸胍一步法，嚴(yán)格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。

1.9 cDNA合成 0.5%焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理過的微量離心管中。

1.10 RT-PCR參數(shù) TNF-α循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；變性94℃ 1 min，退火58℃ 115 min，延伸72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最后延伸2 min。

引物設(shè)計(jì)如下：TNF-α 上游 （5’-3’）：AGG CGC TCC CCA AAA AGA TG；下游（5’-3’）：TGG CGG AGA GGA GGC TGA CT。 β-actin上游（5’-3’）：CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC；下游（5’-3’）：CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT。

2 結(jié) 果

2.1 PCR結(jié)果 TNF-αmRNA在應(yīng)激后第10天表達(dá)最強(qiáng)，以后逐漸達(dá)到正常水平（圖1）；實(shí)驗(yàn)第10天應(yīng)激組和生理鹽水組的各種細(xì)胞因子mRNA升高最顯著，藥物對(duì)照組較以上兩組有所下降并接近對(duì)照組。藥物對(duì)照組和生理鹽水組變化不大，但與對(duì)照組相比明顯增高（圖2）。

圖1 生理鹽水注射組不同時(shí)期各種細(xì)胞因子mRNA水平變化情況

圖2 實(shí)驗(yàn)第10天應(yīng)激組和生理鹽水組的各種細(xì)胞因子mRNA變化

2.2 EISA檢測(cè)結(jié)果 藥物對(duì)照組恢復(fù)至第10天血清中TNF-alpha的OD值經(jīng)t檢驗(yàn)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故可認(rèn)為藥物對(duì)照組恢復(fù)至第10天可達(dá)到正常水平（圖3）。

圖3 藥物對(duì)照組恢復(fù)至第10天血清中TNF-α水平

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，社會(huì)心理因素與TMD的發(fā)生、發(fā)展及治療效果有著密切關(guān)系。甚至有學(xué)者認(rèn)為TMD是一種心身疾病。List等[3]在研究成人TMD患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些心理因素如高水平應(yīng)激、軀體不適、情緒障礙等扮演著更為重要的作用。Kafas等[4]通過問卷調(diào)查、以及曲面斷層X線檢查等手段進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，結(jié)果顯示TMD與患者的心理狀態(tài)關(guān)系密切。基于社會(huì)心理因素與TMD的關(guān)系，許多學(xué)者在治療方面作了一些有益的探索。Turner等[5]應(yīng)用行為認(rèn)知法治療TMD，結(jié)果表明在緩解疼痛及TMJ運(yùn)動(dòng)受限方面效果顯著，在隨后的長(zhǎng)期隨訪中證明該方法療效可靠。此外，催眠療法、生物反饋療法等地運(yùn)用也顯示了較好的效果[6]。

目前，TMD的確切病因和發(fā)病機(jī)理尚不明了，有研究發(fā)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)紊亂癥患者的關(guān)節(jié)局部組織產(chǎn)生大量細(xì)胞因子TNF-α等，然而這些細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、代謝和凋亡的作用機(jī)理和影響途徑迄今尚無定論[7]。TNF-α由單核吞噬細(xì)胞和其它類型細(xì)胞產(chǎn)生并作用于這些細(xì)胞來調(diào)節(jié)粘附分子、免疫球蛋Fc受體、一氧化氮合成和金屬蛋白酶產(chǎn)生及其它細(xì)胞因子分泌，同時(shí)促進(jìn)結(jié)締組織和內(nèi)皮細(xì)胞激活。其主要功能是致炎作用，并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收。已經(jīng)有證據(jù)表明TNF-α在軟骨細(xì)胞的降解-退變過程中起到最重要的分解作用。本文結(jié)果說明1周時(shí)，應(yīng)激組，生理鹽水組大鼠的TMJ髁突軟骨有嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，而隨著時(shí)間增加，炎性反應(yīng)會(huì)漸漸減輕，這可能因?yàn)閼?yīng)激采取了單一的應(yīng)激模式，大鼠漸漸適應(yīng)了這種應(yīng)激方式的原因。而應(yīng)激前給適當(dāng)?shù)牡匚縻愃幬锟梢詼p輕應(yīng)激對(duì)TMJ的影響。

細(xì)胞因子是低分子量蛋白質(zhì)，是炎癥和免疫過程起始因子和效應(yīng)器，其中TNF-β起重要作用。T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后表達(dá)IL-1受體，在IL-1作用下被活化，從而分泌IL-2、IFN、GM-CSF、IL-4等細(xì)胞因子，增加T細(xì)胞表面MHC2類抗原的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF，并通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-8介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用，加速血纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白等的合成[8]。TNF-活化單核／巨噬細(xì)胞，提高其殺傷活性，釋放超氧、促進(jìn)NO、IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，從而參與炎癥反應(yīng)[9]。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)應(yīng)激后各組大鼠軟骨細(xì)胞TNF-α有變化，表明應(yīng)激過程中TNF-α參與了炎癥和免疫過程，當(dāng)應(yīng)激超過一定強(qiáng)度時(shí)，就會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)。

[1]Rosales VP，Ikeda K，Hizaki K，et al.Emotional stress and bruxlike activity of the masseter muscle in rats[J].Eur J Orthod，2002，24(1):107-117.

[2]Funada M，Hara C.Differential effects of psychological stress on activation of the 5-hydroxytryptamine and dopamine-containing neurons in the brain of freely moving rats[J].Brain Res，2001，901（1-2）:247-251.

[3]List T，Wahlund K，Larsson B.Psychosocial functioning and dental factors in adolescents with temporomandibular disorders:a casecontrol study[J].J Orofac Pain，2001，15(3):218-227.

[4]Kafas P，Leeson R.Assessment of pain in temporomandibular disorders:the bio-psychosocial complexity[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2006，35(2):145-149.

[5]Turner JA，Mancl L，Aaron LA.Brief cognitive-behavioral therapy for temporomandibular disorder pain:effects on daily electronic outcome and process measures[J].Pain，2005，117(3):3773-87.

[6]FuK Y，Ma XC，Zhang ZK，et al.Tumor necrosis factor in synovial fluid in patientswith temporomandibular disorders[J].J Oral Maxillofac Surg，1995，35(3):424-425.

[7]Gardea MA，Gatchel RJ，Mishra KD.Long-term efficacy of biobehavioral treatment of temporomandibular disorders[J].J Behav Med，2001，24(4):341-359.

[8]Dalekos GN，Elisaf M，Bairaktarl E，et al.Increased serum levels of Interleukin-1 in the systemic circulation of patients with essential hypertensive patients[J].J Lab Clin Med，1997，129(3)：300-305.

[9]Futrakul N，Buthep P，Patumarys，et al.Enhanced tumor necrosis factor in the serum and renal hyperfusion in nephrosis associated with focal segment glomerlo-sclerosis[J].Ren Fail，2002，22（3）:213-215.