小麥面筋蛋白去酰胺與磷酸化改性的研究

張玲玲，李永祥

（天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

小麥是僅次于玉米的世界上第二大糧食作物，幾乎全部經(jīng)過深加工成為淀粉后用于食用，在這個過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，小麥面筋蛋白就是其中之一。因為小麥面筋蛋白具有優(yōu)良的延展性、黏彈性、薄膜成型性等物理特性，常作為烘焙食品的添加劑使用[1]。然而，因為小麥面筋蛋白中的疏水氨基酸較多，溶解性較低，使得它的乳化性、起泡性、持水吸油性等性質(zhì)都不理想，最終限制了其在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用，所以通過對小麥面筋蛋白進行改性以期得到功能性質(zhì)更好的蛋白質(zhì)。

植物蛋白的改性方法有物理改性、化學改性、酶法改性和基因工程改性等[2]。物理改性是通過適度的熱變性、添加增稠劑、機械處理、擠壓、冷凍、質(zhì)構(gòu)化和超聲波等方式改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和分子間的聚集方式，從而改善植物蛋白的功能性和營養(yǎng)特性，但對設(shè)備要求較高，且較難展開大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用生產(chǎn)[3]。酶法改性雖反應(yīng)條件溫和，但專一性強，需要一定的前處理，反應(yīng)速度較化學方法慢得多，生產(chǎn)周期長且成本昂貴，故在食品中的應(yīng)用仍不多[4]。基因工程技術(shù)周期長、見效慢，目前仍處于實驗室階段，尚未在生產(chǎn)中應(yīng)用[5]?；瘜W改性反應(yīng)時間短、成本低，對設(shè)備要求不高，且改性效果明顯，因此化學改性仍然是蛋白質(zhì)改性的主流方向[6]。Matheis G等人[7]認為利用三聚磷酸鈉對蛋白質(zhì)的改性是安全可行的，它不但改善了蛋白質(zhì)的功能特性，而且不會影響蛋白質(zhì)在體內(nèi)的消化率。唐文婷等人[8]指出利用三聚磷酸鈉對蛋白質(zhì)的改性可以很好地提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性等。因此，選擇去酰胺與磷酸化復(fù)合改性的方法對小麥面筋蛋白進行改性，以提高其功能性質(zhì)，擴大其應(yīng)用領(lǐng)域。改性后的小麥面筋蛋白可作為脂肪模擬物應(yīng)用于運動飲料、嬰幼兒奶粉、脂肪模擬物等食品中替代部分甚至全部脂肪[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白（食品級），河南潤誠化工產(chǎn)品有限公司提供；醋酸、三氯乙酸（分析純），天津市化學試劑一廠提供；多聚磷酸鈉、磷酸氫二、磷酸二氫鈉（分析純），天津市北方天醫(yī)化學試劑廠提供；大豆色拉油（食品級），嘉里糧油（天津）有限公司提供；十二烷基磺酸鈉（分析純），天津市佳興化工有限公司提供。

高溫立式殺菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；Evolution300型紫外-可見分光光度計，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 去酰胺與磷酸化改性小麥面筋蛋白的制備方法

稱取一定量的小麥面筋蛋白溶于0.082 mol/L的醋酸溶液中，配成10%（W/V）的小麥面筋蛋白懸浮液，將其置于水浴鍋中于25℃條件下水化2 h，將得到的樣品懸浮液于121℃滅菌鍋中濕熱處理15 min，（待殺菌鍋預(yù)熱到近100℃時放入樣品），然后快速放氣，取出樣品后立即冰浴冷卻停止反應(yīng)[10]。

用1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，磁力加熱攪拌時分批等量加入一定量的多聚磷酸鈉，反應(yīng)過程中用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH值，維持在加入多聚磷酸鈉前的固定值，維持溫度恒定。反應(yīng)結(jié)束后冷卻，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值為7.0，于4℃條件下透析24 h，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后去上清液，冷凍干燥，粉碎保存。

1.2.2 磷酸化程度的測定方法

采用EDTA滴定法：①用移液槍移取磷酸化反應(yīng)結(jié)束后的上清液5 mL于離心管中，加入過量的10%的三氯乙酸溶液于離心管中用于沉淀蛋白質(zhì)（約20mL），在高速離心機上以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min；②將上清液倒出，給上清液中加入過量的醋酸鋅固體（約0.5 g），同時用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH值在3.8～3.9，會有大量的絮狀沉淀出現(xiàn)，沉淀主要是焦磷酸鋅，在高速離心機上以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min；③將離心獲得的沉淀用氨緩沖溶液（pH值10） 溶解（約30 mL）；④用0.01 mol/L的EDTA標準溶液滴定Zn2+，用鉻黑T作為指示劑，當溶液由酒紅色變?yōu)樗{色時即為滴定的終點；⑤用所用的EDTA的體積表示磷酸化的程度大小。

1.2.3 小麥面筋蛋白乳化性及其乳化穩(wěn)定性的測定[11]

取30 mL質(zhì)量分數(shù)為0.4%（W/V） 的蛋白溶液（溶于0.01 mol/L，pH值7的磷酸鹽緩沖液）和10 mL玉米油，用均質(zhì)機以轉(zhuǎn)速20 000 r/min，溫度20℃的條件下均質(zhì)1 min。用移液槍迅速從底部吸取500 μL溶液，用配制好的0.1%SDS溶液將其定容至50 mL，于波長500 nm處測定其吸光度A0，靜置10 min后，根據(jù)上述同樣操作再次取樣，測定吸光度At。以SDS溶液為空白，做3個平行。

以乳化活力指數(shù)EAI表示：

式中：EAI——每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；

N——稀釋倍數(shù)；

A0——500 nm下0時刻的吸光度；

L——比色池光徑（1 cm）；

φ——體系中油相所占的分數(shù)，試驗中油相占0.25；

C——蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL。

乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)表示：

式中：A0——0時刻的吸光度；

At——t時刻的吸光度；

ΔT——時間差，10 min。

1.2.4 小麥面筋蛋白起泡性及其起泡穩(wěn)定性的測定

取70 mL質(zhì)量分數(shù)為0.2%（W/V） 的蛋白溶液（溶于0.01 mol/L，pH值7的磷酸鹽緩沖液）于100 mL離心管中，用均質(zhì)機在轉(zhuǎn)速20 000 r/min，溫度20℃條件下均值1 min，立刻倒入量筒中，記錄泡沫體積V0。于30 min后記錄體積V30。計算其起泡性和泡沫穩(wěn)定性。起泡性計算公式如下：

式中：V0——均質(zhì)后體積，mL；

V——取樣體積，mL。

起泡穩(wěn)定性計算公式如下：

式中：V30——靜置30 min后體積，mL；

V0——均質(zhì)后體積，mL；

V——取樣體積，mL。

1.2.5 小麥面筋蛋白持水性及吸油性的測定

稱取0.1 g的改性后的蛋白質(zhì)樣品于離心管中，加入適量的水（大豆色拉油） 將樣品完全浸泡，然后用漩渦混合器振蕩1 min，用高速離心機以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min，取出后去上清液，稱質(zhì)量。則持水（吸油）性的計算公式如下：

式中：m0——WGP樣品的質(zhì)量，g；

m1——樣品加離心管的質(zhì)量，g；

m2——離心后離心管加沉淀的質(zhì)量，g。

1.2.6 小麥面筋蛋白的傅里葉紅外光譜測定

準確稱量1 mg樣品與150 mg干燥的溴化鉀，用瑪瑙研缽將其充分研磨至細末貼壁，顆粒直徑2 μm左右。使用壓片機將混合粉末壓制成透明薄片，用紅外光譜儀做全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為16次，分辨率為4%，以空氣為采集背景，樣品紅外光譜圖經(jīng)過傅立葉變換得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 未改性小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測定結(jié)果

對未改性小麥面筋蛋白的功能與性質(zhì)進行測定和分析。

未改性與去酰胺小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測定結(jié)果見表1。

表1 未改性與去酰胺小麥面筋蛋白功能性質(zhì)的測定結(jié)果

由表1可知，未改性小麥面筋蛋白的起泡性、乳化性等功能特性都相對較差，這就限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。去酰胺改性后，小麥面筋蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、持水和吸油性都有明顯的提高[11]。然而，經(jīng)過去酰胺改性后的小麥面筋蛋白溶于水之后依舊呈現(xiàn)一種面筋狀，因此對于去酰胺小麥面筋蛋白進行磷酸化改性考查其功能性質(zhì)。

2.2 磷酸化改性小麥面筋蛋白的研究

在磷酸化改性的過程中，選擇反應(yīng)時間、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度和磷酸化試劑的添加量進行單因素試驗，每組單因素選擇5個梯度進行試驗。

2.2.1 反應(yīng)時間對磷酸化改性的影響

反應(yīng)pH值9.0，反應(yīng)溫度25℃，磷酸化試劑添加量15%（多聚磷酸鈉質(zhì)量/小麥面筋蛋白質(zhì)量），考查反應(yīng)時間為10，20，30，40，50 min時對小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。選擇5個時間點，通過5個時間梯度EDTA的用量來確定磷酸化的程度，以此來判斷什么時間磷酸化的程度最高、反應(yīng)最徹底。

反應(yīng)時間對小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)時間對小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

由圖1可知，在加入磷酸化試劑的0～30 min內(nèi)，反應(yīng)時間越長反應(yīng)越徹底；當反應(yīng)時間超過30 min時，磷酸化反應(yīng)程度反而減低；達到40 min時，反應(yīng)趨于穩(wěn)定。由此，反應(yīng)時間在30 min時磷酸化程度最大、反應(yīng)最徹底。

反應(yīng)時間對復(fù)合改性產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響見表2。

表2 反應(yīng)時間對復(fù)合改性產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響

由表2可知，在30 min之前，隨著反應(yīng)時間的延長，產(chǎn)物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性均逐漸增強，超過30 min后，功能性質(zhì)均逐漸下降，這與磷酸化反應(yīng)程度的變化相一致。所以最佳反應(yīng)時間是30 min。且通過比較復(fù)合改性和去酰胺改性后蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合改性的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性均有所提高，且復(fù)合改性后的產(chǎn)物溶于水之后不會有面筋形成。

2.2.2 反應(yīng)pH值對磷酸化改性的影響

反應(yīng)時間40 min，反應(yīng)溫度25℃，磷酸化試劑添加量15%，考查反應(yīng)pH值為5，7，9，11，13時對小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

反應(yīng)pH值對小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)pH值對小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

由圖2可知，反應(yīng)pH值在5～9時，磷酸化程度先降低后升高，反應(yīng)pH值在11～13時，磷酸化程度明顯降低，當反應(yīng)pH值為9時磷酸化程度達到最大，推測蛋白質(zhì)在堿性較大的情況下會發(fā)生變性，從而影響磷酸化，使蛋白質(zhì)的磷酸化程度降低[12]。

反應(yīng)pH值對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見表3。

當反應(yīng)pH值為9時，其乳化性、起泡性相比其他反應(yīng)pH值較高，雖然反應(yīng)pH值為13時乳化和起泡性均較高，但是堿性太大、蛋白質(zhì)容易變性，所以選擇pH值9為最佳改性條件。

2.2.3 反應(yīng)溫度對磷酸化改性的影響

反應(yīng)時間40 min，反應(yīng)pH值9，磷酸化試劑添加量15%，考查反應(yīng)溫度為25，35，45，55，65℃時對小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

表3 反應(yīng)pH值對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

反應(yīng)溫度對于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

隨著反應(yīng)溫度的升高，磷酸化程度逐漸增大，當反應(yīng)溫度達到45℃時磷酸化程度最高，當反應(yīng)溫度超過45℃時磷酸化程度迅速下降。

反應(yīng)溫度對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見表4。

表4 反應(yīng)溫度對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

在反應(yīng)溫度為45℃時產(chǎn)物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性最好。因此，最佳反應(yīng)溫度為45℃。

2.2.4 磷酸化試劑添加量對磷酸化改性的影響

反應(yīng)時間40 min，反應(yīng)pH值9，反應(yīng)溫度25℃，考查磷酸化試劑添加量為5%，10%，15%，20%，25%時對小麥面筋蛋白磷酸化改性的影響。

磷酸化試劑添加量對于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響見圖4。

隨著磷酸化試劑添加量的增多，磷酸化的程度逐漸變大，當磷酸化試劑添加量達到25%時磷酸化程度最大，再增加磷酸化試劑添加量，磷酸化程度逐漸趨于穩(wěn)定甚至有所下降，可能是大量的多聚磷酸鈉使溶液濃度增大，抑制反應(yīng)發(fā)生。

磷酸化試劑添加量對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響見表5。

圖4 磷酸化試劑添加量對于小麥面筋蛋白磷酸化程度的影響

表5 磷酸化試劑量對小麥面筋蛋白復(fù)合改性功能性質(zhì)的影響

隨著磷酸化程度的加大，小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)均有所提高，當磷酸化試劑添加量達到25%時，功能性質(zhì)達到最大，因此最佳磷酸化試劑添加量為25%。

通過單因素試驗可知，去酰胺小麥面筋蛋白磷酸化改性的最佳條件為反應(yīng)時間30 min，反應(yīng)pH值9，反應(yīng)溫度45℃，磷酸化試劑添加量25%。

2.3 小麥面筋蛋白前后的紅外分析

未改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見圖5，去酰胺改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見圖6，復(fù)合改性小麥面筋蛋白的紅外光譜見圖7。

圖5 未改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

由圖2～圖5可知，3 301 cm-1附近的特征吸收峰為N-H的伸縮振動吸收帶，1 657 cm-1附近的特征吸收峰為酰胺基團上C=O鍵的伸縮振動；1 537 cm-1附近的特征吸收峰為N-H鍵的彎曲振動；1 450 cm-1附近的特征吸收峰為C-N伸縮振動。這些均為小麥面筋蛋白紅外光譜圖的特征吸收譜[13]。由圖6可知，3 284 cm-1附近的特征吸收峰為羧基上-OH的彎曲振動，1 654 cm-1附近的特征吸收峰為羧基上C=O鍵的伸縮振動。1 312 cm-1附近的特征吸收峰為C-O單鍵的伸縮振動[14]。由圖5和圖6中可知，3 301 cm-1和1 657 cm-1附近吸收峰的變化說明有部分的酰胺基團在去酰胺改性后變成了羧基。由圖7可知，由于蛋白質(zhì)中的側(cè)鏈-OH、-NH2上連接了磷酸基團。所以，在1 073 cm-1和1 035 cm-1處出現(xiàn)氨基酸-PO32-和氨基酸-P-O-C的明顯吸收峰[15]。同時，在3 800 cm-1和2 900 cm-1處的裂分減少，可能是因為蛋白質(zhì)中的-OH，-NH2因磷酸根離子替代而消失。

圖6 去酰胺改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

圖7 復(fù)合改性小麥面筋蛋白的紅外光譜圖

3 結(jié)論

對小麥面筋蛋白進行磷酸化改性的單因素試驗，得出改性的最佳條件為反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)pH值9，反應(yīng)時間30 min，多聚磷酸鈉添加量25%。紅外譜圖分析也驗證了改性確實成功了。對改性前后的小麥面筋蛋白進行功能性質(zhì)的測定，發(fā)現(xiàn)去酰胺與磷酸化復(fù)合改性后的小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)比未改性和去酰胺改性的小麥面筋蛋白的功能性質(zhì)均提高不少，這無疑是一個變廢為寶的過程，日后可將其添加到運動飲料中，可直接補充蛋白質(zhì)，添加到老年人的保健品中可平衡飲食結(jié)構(gòu)等。

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