自擬益智方結(jié)合音樂(lè)治療對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠的干預(yù)研究*

于向榮 周 勤 苗玉榮

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases，AD)又稱老年性癡呆，是老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損失為主要臨床表現(xiàn)，其特征性病理改變主要有β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、炎癥與細(xì)胞凋亡異常等[1]。伴隨著全球人口老齡化的進(jìn)一步加劇，有學(xué)者預(yù)言：到2050年全球AD患者總數(shù)將會(huì)突破億人大關(guān)[2],中國(guó)占據(jù)了全球總發(fā)病人數(shù)的1/4，一直被視為AD的高發(fā)地區(qū)[3]。AD嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并給家庭與社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。臨床上采用中醫(yī)藥及音樂(lè)治療AD均取得了一定的成果，但將這2種治療方式結(jié)合應(yīng)用的研究較少。本項(xiàng)目組將臨床實(shí)踐中摸索總結(jié)的有效方劑結(jié)合音樂(lè)治療應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、腦內(nèi)生化指標(biāo)檢測(cè)及腦組織病理學(xué)方面對(duì)AD模型小鼠的干預(yù)情況，從而為AD治療提供更為有效的新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料普通級(jí)雌性NIH小鼠75只，體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK (湘)2016-0002。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)使用普通鼠飼料，自由飲水。飼養(yǎng)室控制溫度20～25 ℃，濕度40%～60%。自擬益智方包括黃芪、當(dāng)歸、川芎、絞股藍(lán)、遠(yuǎn)志、石菖蒲、熟地黃、何首烏等(購(gòu)買于江西黃慶仁棧華氏大藥房連鎖藥店，臨用前制備成水煎劑，低溫保存?zhèn)溆?；鹽酸多奈哌齊片(重慶植恩藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010723，產(chǎn)品批號(hào)20171101)；D-半乳糖(上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑二廠)；亞硝酸鈉為市售分析純；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE) 測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，一次性注射器(湖南平安醫(yī)械科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及干預(yù)方法普通級(jí)雌性NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、AD模型組(簡(jiǎn)稱模型組)、自擬益智方(26 mg·kg-1·d-1)組、自擬益智方結(jié)合音樂(lè)組(簡(jiǎn)稱結(jié)合組)及多奈哌齊(0.75 mg·kg-1·d-1)組,每組15只。結(jié)合組每天選擇輕快、舒緩類型音樂(lè)重復(fù)播放1 h，模型組和給藥各組腹腔注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1(生理氯化鈉溶液配制)和亞硝酸鈉90 mg·kg-1·d-1(雙蒸水配制),連續(xù)60 d,對(duì)照組腹腔注射等量的生理氯化鈉溶液。從第47天開始，給藥各組灌胃益智方和多奈哌齊,連續(xù)14 d,對(duì)照組和模型組灌胃等量的生理氯化鈉溶液[4]。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)60 d后各組小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，分為連續(xù)5 d的隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)和第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)時(shí)，每天在同一時(shí)間訓(xùn)練小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同區(qū)域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，找到平臺(tái)，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺(tái)，記錄其從入水到找到平臺(tái)所用的時(shí)間，即逃避潛伏期。60 s內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)的要將其引導(dǎo)到平臺(tái)上，停留15 s，按60 s計(jì)算逃避潛伏期。每次訓(xùn)練間隔1 h左右。隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 h后立即進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，把第5區(qū)的平臺(tái)去掉，讓小鼠在第2象限入水，檢測(cè)在60 s內(nèi)小鼠在平臺(tái)區(qū)出現(xiàn)的頻次。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)獲得能力，空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間記憶能力[5]。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組取10只小鼠禁食12 h,斷頭處死,立即取全腦(嗅腦除外)稱重后置玻璃勻漿器中,加入預(yù)冷的生理氯化鈉溶液,制成10%腦組織勻漿，3500 r·min-1離心10 min,取上清置于冰水浴中。小鼠腦組織AchE和SOD活力用比色法測(cè)定，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合比色法，具體操作步驟及計(jì)算公式按試劑盒說(shuō)明。

1.2.4 小鼠腦組織病理切片檢查小鼠用4%多聚甲醛灌注后取腦，全腦浸置于4%多聚甲醛中固定24 h以上,石蠟包埋,行冠狀切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察腦組織海馬區(qū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，平臺(tái)穿越頻次顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)各組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，平臺(tái)穿越頻次顯著增多(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期和平臺(tái)穿越頻次比較 (只，

2.2 對(duì)AD模型小鼠腦組織蛋白含量、AchE、SOD的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD活性顯著降低(P<0.01)，AchE水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，干預(yù)各組小鼠腦組織中SOD活性顯著升高(P<0.01)，AchE水平顯著降低(P<0.01)。干預(yù)各組小鼠腦蛋白質(zhì)含量雖然有增多趨勢(shì)，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦內(nèi)蛋白含量、AchE、SOD活性比較 (只，

2.3 對(duì)AD模型小鼠腦組織病理形態(tài)的影響對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)分層清楚，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，尼氏體分布均勻，神經(jīng)纖維未見纏結(jié)；模型組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清，尼氏體變淡，神經(jīng)纖維纏結(jié)明顯，部分區(qū)域見神經(jīng)元變性、凋亡現(xiàn)象，可見嗜神經(jīng)現(xiàn)象；干預(yù)各組小鼠大腦皮層細(xì)胞排列較規(guī)則，部分區(qū)域細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰，神經(jīng)纖維纏結(jié)不明顯，神經(jīng)元變性現(xiàn)象少見；特別是結(jié)合組小鼠與模型組比較明顯改善，大部分區(qū)域神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞核清晰，尼氏體較均勻豐富，神經(jīng)纖維無(wú)明顯纏結(jié)，可見衛(wèi)星現(xiàn)象。見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織病理形態(tài)觀察

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有諸多假說(shuō)，如膽堿能神經(jīng)元學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等，針對(duì)的治療靶點(diǎn)也是多種多樣。海馬區(qū)存在大量的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì),與機(jī)體學(xué)習(xí)、記憶有密切聯(lián)系, AchE是反映膽堿能系統(tǒng)功能的重要標(biāo)記，它能把突觸間隙中的Ach降解，使其含量降低。因此，降低AchE活力，從而提升腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能可能是抗衰老和改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)理之一[6]。Aβ聚集可啟動(dòng)自由基發(fā)生，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷,被認(rèn)為是導(dǎo)致許多神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制[7]。SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御體系關(guān)鍵的組成酶類，是重要的自由基清除劑，抑制過(guò)氧化物對(duì)神經(jīng)組織的毒害。本研究結(jié)果顯示，自擬益智方結(jié)合音樂(lè)治療可以提高 D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導(dǎo)的AD模型小鼠腦組織中SOD活性，同時(shí)降低腦內(nèi)AchE活力。

中醫(yī)將AD歸于“呆病”范疇，其病位在腦，發(fā)病機(jī)制多為本虛標(biāo)實(shí)，內(nèi)因?yàn)橹??；颊吣昀象w衰，臟腑機(jī)能衰退，精氣虧損，髓海失充，神機(jī)失用；加上氣虛推動(dòng)無(wú)力，津血輸布異常，血瘀痰阻，閉塞清竅[8]。中醫(yī)治療AD的歷史由來(lái)已久，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且中醫(yī)藥復(fù)方由于其成分的多樣性，可以作用于多靶點(diǎn)、多途徑經(jīng)，發(fā)揮協(xié)同作用。益智方中的熟地黃、何首烏味甘性微溫，歸肝腎經(jīng)，質(zhì)地柔潤(rùn)，滋陰補(bǔ)血，益精填髓，均為補(bǔ)益肝腎精血的常用要藥。精血同源，脾為后天之本，氣血生化之源，主升清。黃芪味甘性微溫，擅長(zhǎng)補(bǔ)脾益氣，補(bǔ)氣生血，升舉清陽(yáng)，將精微物質(zhì)上輸頭面清竅。當(dāng)歸味甘辛性溫，為補(bǔ)血活血要藥，用以補(bǔ)血可使補(bǔ)而不滯，用以活血可使祛邪不傷正?！毒霸廊珪分^之：“補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，誠(chéng)血中之氣藥，亦血中之圣藥也?！秉S芪與當(dāng)歸相配，亦合當(dāng)歸補(bǔ)血湯之意，精血同源，補(bǔ)血以養(yǎng)精。川芎被稱為“血中氣藥”，味辛性溫，辛香走竄，即能活血又能行氣，性善“上行頭目”，載諸藥上行，直達(dá)病所。清代陳士鐸在《辨證錄·呆證門》中指出：“痰積于胸中，盤據(jù)于心外，使神明不清，而成呆病矣”。遠(yuǎn)志，味苦辛性微溫，辛開苦降，宣泄通達(dá)，主入心腎經(jīng)，既能祛痰利心竅而寧心安神，又能通腎氣而強(qiáng)志不忘。《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其可以“補(bǔ)不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強(qiáng)志，倍力?！?石菖蒲，味辛苦性溫，辛開苦燥溫通，芳香走竄，長(zhǎng)于開心竅、祛濕濁、醒神志。石菖蒲長(zhǎng)于辛散溫通開竅醒神，遠(yuǎn)志苦降上逆之痰窒效果更佳，兩藥相配可使氣順而壅滯自開，痰濁消散不蒙清竅，神志可清?！蹲C治準(zhǔn)繩》的不忘散、《醫(yī)學(xué)心悟》的安神定志丸、《備急千金要方》的開心散等安神益智方劑中都配伍了遠(yuǎn)志和石菖蒲。絞股藍(lán)味甘苦性寒，歸肺脾腎經(jīng)，益氣健脾，化痰清熱。此外，方中配伍絞股藍(lán)還可以制約方中溫性藥物的溫燥偏頗之性。現(xiàn)代藥理研究顯示,熟地黃、何首烏、黃芪、川芎、遠(yuǎn)志、石菖蒲、絞股藍(lán)等藥物的活性成分具有很好的抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。熟地黃、何首烏、遠(yuǎn)志、石菖蒲、絞股藍(lán)等藥物的活性成分還具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，改善認(rèn)知功能障礙等作用[9-13]。

音樂(lè)治療可以使AD患者通過(guò)以音樂(lè)旋律和詞語(yǔ)信息為媒介的交流刺激，更為廣泛地激活相應(yīng)神經(jīng)系統(tǒng)，包括皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而提高AD患者的記憶功能[14-19]。音樂(lè)治療還能夠改善AD患者的抑郁、焦慮、失眠、激越等情緒和精神行為癥狀[20-25]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，在治療AD等復(fù)雜病癥中將人視為一個(gè)有機(jī)整體，把有效干預(yù)AD的方法有機(jī)整合，越來(lái)越成為一種趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自擬益智方結(jié)合音樂(lè)治療對(duì) D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導(dǎo)的AD小鼠有一定神經(jīng)保護(hù)作用，可以改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，產(chǎn)生抗 AD的藥理作用。其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高小鼠腦組織中SOD活性，提高機(jī)體的抗氧化及自由基的清除能力；同時(shí)降低AchE活力，從而提升腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。