超高效液相色譜法測定煙草中順-冷杉醇

付秋娟，杜詠梅，王愛華，劉艷華，韓 曉，張曉敬

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號 266101

冷杉醇屬于賴百當(dāng)類萜醇，廣泛存在于冷杉油樹脂尤其是香脂冷杉［Abies balsamea（L.）Mill.］中［1］。目前報道的冷杉醇均為順-冷杉醇，自然界還未見有關(guān)反-冷杉醇存在的報道［1-2］。煙草賴百當(dāng)類萜醇最早由Giles 等［3］從陳化的土耳其香料煙中分離得到，其中，順-冷杉醇為煙草主要的賴百當(dāng)類萜醇。順-冷杉醇與西柏三烯二醇、糖酯均為煙草表面腺毛分泌物的主要成分，是煙草香氣成分的重要前體物質(zhì)［4-6］。煙葉在調(diào)制、醇化過程中，順-冷杉醇會降解轉(zhuǎn)化為降龍涎香醚、龍涎香內(nèi)酯等具有令人愉快的龍涎香香氣的物質(zhì)［4-5］。另外，有研究表明，順-冷杉醇在煙草抗蟲、抗病和抵御其他微生物侵染過程中也起著重要作用［2,7-9］。早期的研究表明，順-冷杉醇主要存在于香料煙和雪茄煙中［10］。近年來，王國平［11］在我國特香型烤煙品種大白筋599 中檢測到順-冷杉醇，李艷華等［12］發(fā)現(xiàn)我國高香氣烤煙品種豫煙11 號也含有順-冷杉醇。煙葉中香氣成分的準(zhǔn)確、高效檢測是高香氣煙草種質(zhì)資源篩選、煙葉香氣品質(zhì)評價的重要手段之一，長期以來備受關(guān)注，但目前有關(guān)順-冷杉醇檢測方法研究的報道較少。Severson等［10］建立了測定煙葉表面化合物的氣相色譜方法，但順-冷杉醇的熱穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致其色譜峰峰型較差，難以準(zhǔn)確定量。Ding 等［13］建立了測定煙草順-冷杉醇的正相色譜方法，但正相液相色譜分析儀器普適性較差，且該方法樣品前處理步驟較為繁瑣。本研究中針對目前順-冷杉醇測定方法存在的問題，以香料煙代表品種沙姆遜（Samsun）煙葉樣品為實驗材料，通過優(yōu)化樣品前處理和儀器測定條件，建立測定煙草順-冷杉醇的反相液相色譜方法，同時，以特香型烤煙品種大白筋599 為實驗材料，測定烤煙煙葉調(diào)制前后順-冷杉醇含量的變化，旨在為含有順-冷杉醇的高香氣煙草種質(zhì)篩選、品質(zhì)評價、栽培及生物調(diào)控等研究提供檢測技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

采集香料煙品種沙姆遜（Samsun）新鮮煙葉樣品，用凍干機冷凍干燥，粉碎，過250 μm（60 目）篩，4 ℃下保存，作為煙草順-冷杉醇檢測方法研究的樣品。以烤煙品種大白筋599［14］為材料，于2016 年在山東臨朐五井煙草試驗站種植，在成熟采烤期隨機選取中部成熟葉片15 片，采用半葉法處理，即每片葉片均從煙筋邊緣分開，其中，一半煙葉按當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程烘烤，另一半煙葉冷凍干燥，粉碎，過 250 μm 篩，4 ℃下保存，作為分析煙葉烘烤前后順-冷杉醇含量差異的樣品。

順-冷杉醇（96%，北京百靈威科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚（AR，中國醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（符合GB/T 6682—2008 中一級水的要求）。

H-Class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；TDZ 5-WS 臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；ALPHA1-2 冷凍干燥機（德國Christ 公司）；WD-12 水浴氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；SBL-30DT 超聲波恒溫清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；ME414S 電子天平（感量：0.000 1 g，德國Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取順-冷杉醇對照品，用無水乙醇配制成濃度為0.5000 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用70%乙腈稀釋，配制成濃度分別為1.600、5.000、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以上標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于4 ℃下保存。

1.2.2 樣品前處理與分析

準(zhǔn)確稱取0.1g（精確至0.000 1 g）煙草粉末樣品，放入20 mL 具塞離心管中（帶聚四氟乙烯密封蓋），準(zhǔn)確加入5 mL 二氯甲烷作為提取劑，旋緊密封蓋，20 ℃條件下超聲提取10 min。提取完成后，準(zhǔn)確移取上清液2 mL，在氮氣保護條件下吹干，再準(zhǔn)確移取 1 mL 流動相溶解，用 0.22 μm 有機相濾膜過濾，待測。UPLC-UV 分析條件為：

色 譜 柱 ：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：70%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈-水溶液，進樣量3 μL；等度洗脫；流速：0.3 mL/min；檢測波長：237 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

流動相選擇：流動相對色譜分離影響較大，根據(jù)順-冷杉醇的結(jié)構(gòu)特點，本研究中選擇常用的反相液相色譜柱C18柱為分離柱，分別考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液（40%～80%）作為流動相等度洗脫的分離效果，結(jié)果顯示，以70%乙腈作為流動相等度洗脫時，分析時間較短，目標(biāo)峰峰型較好，且與雜峰分離度較好。因此，采用70%乙腈-水溶液進行等度洗脫。

吸收波長選擇：根據(jù)順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜（190～300 nm）掃描結(jié)果（圖1），順-冷杉醇在237 nm 有最大吸收峰，本研究中選擇檢測波長為237 nm。文獻［13］中報道的正相色譜法檢測波長為254 nm，由圖1 可以看出，順-冷杉醇在254 nm處的吸光度較低，因此以254 nm 作為檢測波長會使方法的靈敏度降低。

流動相流速選擇：考察了不同流動相流速（0.3、0.4、0.5 mL/min）下順-冷杉醇的保留時間以及其與雜質(zhì)峰的分離情況，選擇流動相的流速為0.3 mL/min。

圖1 順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液190～300 nm 吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of cis-abienol standard solution in 190-300 nm

柱溫選擇：考察了色譜柱溫度（30、35、40 ℃）變化對順-冷杉醇保留時間及分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)色譜柱溫度對目標(biāo)化合物保留時間及分離效果的影響較小。因此，選擇色譜柱溫度為35 ℃。

基于以上色譜條件，得到順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和煙草樣品的液相色譜圖（圖2）。由圖2 可知，順-冷杉醇的保留時間較短，峰型較好，且與其他成分實現(xiàn)了較好分離。對比氣質(zhì)聯(lián)用儀方法（圖3）可以看出，氣相色譜分析條件下，順-冷杉醇的色譜峰出現(xiàn)明顯分叉，峰型較差。

圖2 順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和煙草樣品(b)液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of cis-abienol standard solution (a) and tobacco sample (b)

圖3 順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液氣質(zhì)聯(lián)用總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of cis-abienol standard solution by GC-MS

2.2 樣品前處理條件的確定

2.2.1 提取溶劑選擇

分別以甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正己烷作為提取溶劑，對不同溶劑提取煙草順-冷杉醇含量的測定結(jié)果進行了比較（表1）。由表1 可以看出，以弱極性溶劑二氯甲烷作為提取溶劑，測定出的目標(biāo)化合物含量最高，其次是極性溶劑（乙醇、乙腈、甲醇、丙酮）和中極性溶劑（乙酸乙酯），這5 種溶劑對煙草順-冷杉醇含量的測定結(jié)果影響不顯著，使用非極性溶劑（正己烷、石油醚）時，順-冷杉醇含量最低。順-冷杉醇是只含有一個羥基的冷杉烷型二萜醇，屬弱極性化合物，根據(jù)相似相容原理，這可能是弱極性提取溶劑二氯甲烷對其提取效果較好的主要原因。因此，選擇二氯甲烷作為提取溶劑。本研究中以二氯甲烷作為提取溶劑，煙葉中的色素、甾醇等脂溶性成分也會被提取出來。將提取液氮吹干，再用70%的乙腈溶液溶解后檢測，部分脂溶性成分由于在70%的乙腈中的溶解性較低，而未被轉(zhuǎn)移至檢測液中，減少了脂溶性成分對色譜柱的污染。本方法與文獻［13］報道的固相萃取純化方法相比，操作較簡單，成本降低。

表1 不同提取溶劑對順-冷杉醇測定結(jié)果的影響(n=6)Tab.1 Effects of different extraction solvents on extraction efficiencies of cis-abienol (n=6)

2.2.2 液料比選擇

分別稱取 0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g（精確至0.000 1 g）煙草粉末樣品，加入5.000 mL二氯甲烷，在20 ℃下超聲提取15 min，考察不同液料比對測定結(jié)果的影響。結(jié)果（表2）表明：液料比在100∶0.5～100∶3 范圍內(nèi)，煙草順-冷杉醇含量的測定結(jié)果顯著較好；液料比小于100∶4 時，隨著液料比的降低，測定出的順-冷杉醇含量呈極顯著降低趨勢。綜合考慮，液料比對測定結(jié)果的影響以及稱量誤差，選擇提取條件為稱樣量0.1 g，加入 5 mL 提取溶劑，液料比為 100∶2。已有報道［13］的正相色譜檢測方法中提取溶劑用量為20 mL，是本方法提取溶劑用量的4 倍。因此，本方法的提取溶劑用量較低，具有檢測成本低、環(huán)境友好的特點。

表2 不同料液比對順-冷杉醇測定結(jié)果的影響（n=6）Tab.2 Effects of material to solution ratio on extraction efficiencies of cis-abienol（n=6）

2.2.3 提取溫度選擇

以二氯甲烷為提取溶劑，在提取時間15 min條件下，考察了提取溫度對順-冷杉醇含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果（表3）表明，在20～50 ℃范圍內(nèi)，提取溫度對順-冷杉醇影響不大。這可能與順-冷杉醇存在于煙草表面，較易提取有關(guān)。因此，選擇提取溫度為20 ℃。

表3 不同提取溫度對順-冷杉醇測定結(jié)果的影響(n=6)Tab.3 Effects of extraction temperature on extraction efficiencies of cis-abienol (n=6)

2.2.4 提取時間選擇

以二氯甲烷為提取溶劑，20 ℃條件下，考察了超聲提取時間對順-冷杉醇含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果（表4）表明，在10～30 min 范圍內(nèi)，提取時間對順-冷杉醇的影響不大。這也可能與順-冷杉醇存在于煙草表面，且易提取有關(guān)［1］。因此，選擇目標(biāo)化合物的提取時間為10 min。

表4 不同提取時間對順-冷杉醇測定結(jié)果的影響(n=3)Tab.4 Effects of extraction time on extraction efficiencies of cis-abienol (n=3)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 工作曲線、檢出限及方法定量限

采用優(yōu)化確定的條件對順-冷杉醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，獲得順-冷杉醇濃度（Y）與峰面積（X）的線性回歸方程：Y=38 700X+18 500，決定系數(shù)R2為0.999 9。順-冷杉醇在1.60～80.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)，工作曲線線性良好（圖4）。

圖4 順-冷杉醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of cis-abienol content

以3 倍信噪比計算的順-冷杉醇的方法檢出限（3 S/N）為4.00 μg/g，以10 倍信噪比計算的方法定量限（10 S/N）為13.30 μg/g，低于文獻［13］正相色譜方法的定量限（72.80 μg/g）。可見，本方法檢出限及定量限均較低，方法靈敏度較高。

2.3.2 回收率及精密度

稱取煙草樣品0.1 g（順-冷杉醇本底值為0.062 8 mg），進行順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)品添加回收實驗。順-冷杉醇添加量設(shè)置3 個處理，分別為0.031、0.062、0.124 mg，每處理 6 次重復(fù)。利用本文建立的方法進行前處理，并采用優(yōu)化的色譜條件進行分析，計算順-冷杉醇標(biāo)準(zhǔn)品不同添加量條件下的回收率，各處理以6 次重復(fù)回收率測定結(jié)果的RSD 評價UPLC 測定方法的精密度。結(jié)果（表5）表明，在不同加標(biāo)量條件下，順-冷杉醇回收率為97.63%～109.80%，回收率的RSD 為2.05%～3.69%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高，精密度較好，符合定量分析要求。

2.3.3 方法重現(xiàn)性

取同一份煙草樣品，運用本方法，連續(xù)6 d 測定樣品中順-冷杉醇含量，其結(jié)果分別為0.629、0.612、0.598、0.642、0.659、0.630 mg/g，平均含量為0.628 mg/g，RSD 為3.43%，表明本方法重現(xiàn)性較好，符合定量分析要求。

2.4 實際樣品分析

大白筋599 被認(rèn)為是我國具有類似沙姆遜香氣特征的特香型烤煙品種，順-冷杉醇的含量較高。采用本方法對烤煙品種大白筋599 葉片烘烤前后順-冷杉醇含量進行了檢測。15 份煙葉樣品半葉法進行的烘烤前后順-冷杉醇含量配對t 檢驗結(jié)果（表6）表明，煙葉烘烤前后順-冷杉醇含量差異顯著（t=2.826 4，P=0.012 8），順-冷杉醇在調(diào)制過程中大部分降解，降解率為27.92%～89.23%，平均63.66%。

表5 順-冷杉醇回收率和精密度(n=6)Tab.5 Recoveries and RSDs of cis-abienol (n=6)

表6 煙葉烘烤前后順-冷杉醇含量及降解率Tab.6 Contents and degradation rates of cis-abienol in tobacco leaves before and after flue-curing

3 結(jié)論

①通過優(yōu)化樣品提取和液相色譜分離條件，建立了測定煙草粉末樣品中順-冷杉醇的反相液相色譜方法，本方法回收率為97.63%～109.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.05%～3.69%，方法檢出限為4.00 μg/g，定量限為13.30 μg/g；②通過半葉法研究了烤煙品種大白筋599 調(diào)制前后煙葉順-冷杉醇含量差異，發(fā)現(xiàn)在調(diào)制過程中順-冷杉醇大部分降解，這也進一步證明了順-冷杉醇熱穩(wěn)定性較差的特性；③本方法具有樣品前處理簡單、分析時間短、分離度好、靈敏度高、節(jié)約溶劑、檢測成本低等優(yōu)點，適用于煙葉粉末樣品順-冷杉醇的批量檢測。