LXRs過表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其機(jī)制

周江龍 王云開 歐陽(yáng)先國(guó) 黃瑛

(1南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330009；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

糖尿病心肌病(DCM)是以心室功能不全為主要表現(xiàn)的疾病，其獨(dú)立于高血壓、冠心病等，特點(diǎn)是心肌肥厚、心肌擴(kuò)張、左心室舒張和收縮功能下降，最終進(jìn)展為心力衰竭，是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一〔1〕。代謝紊亂、微血管病變、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、鈣離子調(diào)節(jié)失衡、心肌間質(zhì)纖維化、心臟自主神經(jīng)病變及微RNA(miRNA)等多種因素參與DCM的發(fā)病，但尚未完全闡明〔2〕。高血糖是導(dǎo)致DCM的關(guān)鍵，長(zhǎng)期高血糖不僅能直接引起心肌細(xì)胞的損害，還可通過使晚期糖基化終末產(chǎn)物、心肌細(xì)胞活性氧(ROS)的水平增加，激活核因子(NF)-κB，最終引起心肌肥厚和纖維化〔3〕。肝X受體(LXRs)是人體重要的核受體，在糖脂代謝、炎癥、凋亡中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)LxRs可能在治療炎癥相關(guān)疾病中起重要作用，是一個(gè)重要治療靶點(diǎn)〔4〕。至今，尚未完全闡明DCM的發(fā)病機(jī)制，但在DCM的發(fā)生發(fā)展中炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵作用，研究LXRs能否通過抑制炎癥反應(yīng)來(lái)改善DCM發(fā)生發(fā)展有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過利用高糖誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，分析過表達(dá)LXRs對(duì)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其抗炎機(jī)制，為DCM的預(yù)防與治療提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2細(xì)胞(大鼠胚胎心肌細(xì)胞株)。低糖和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó) Hyclone公司；含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉購(gòu)于美國(guó)Simga公司；CCK-8溶液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒、qPCR Mix購(gòu)于美國(guó)GeneCopoeia公司；TRIzol reagent、PCR引物購(gòu)于美國(guó)invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)、總蛋白提取試劑盒均購(gòu)于Vazyme有限公司；兔抗NF-κB p65磷酸化抗體購(gòu)于CST公司；SuperSignal West Femto trial kit購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2過表達(dá)LXRs慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 LXRs主要包括LXRα(Nr1h3)和LXRβ(Nr1h2)兩個(gè)亞型，按照試劑盒成功構(gòu)建和轉(zhuǎn)染LXRs慢病毒載體，選擇(10、20、40、60)的感染復(fù)數(shù)(MOI)值在不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h、96 h)感染H9C2細(xì)胞，后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，確定最適MOI值和時(shí)間。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：H9C2細(xì)胞由低糖DMEM培養(yǎng)，無(wú)干預(yù)；高糖組：H9C2細(xì)胞由低糖DMEM培養(yǎng)同前，24 h后加入33 mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)；③LXRα組：H9C2細(xì)胞由低糖DMEM培養(yǎng)同前，24 h后轉(zhuǎn)染LXRα過表達(dá)慢病毒，8 h后換液加入33 mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)；④LXRβ：轉(zhuǎn)染LXRβ過表達(dá)慢病毒，余同LXRα組；⑤空載體組：轉(zhuǎn)染空病毒載體，余同LXRα組。

1.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，在96孔板中加入細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(5 000個(gè)細(xì)胞)，慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)在箱內(nèi)孵育0.5～4.0 h，后酶標(biāo)儀測(cè)光密度(OD)值，后計(jì)細(xì)胞增殖抑制率=〔1-(處理組-空白對(duì)照)/(正常組-空白對(duì)照)〕×100%。

1.5qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞LXRα、LXRβ及炎癥因子人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、白細(xì)胞介素(IL)-6、人腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的表達(dá) 按產(chǎn)品說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。各取2 μl cDNA在20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá) 按產(chǎn)品說(shuō)明書提取總蛋白，然后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，加入Ⅰ抗和Ⅱ抗行免疫反應(yīng)，最后化學(xué)發(fā)光，顯影。按試劑盒進(jìn)行操作，得出NF-κB p65磷酸化蛋白表達(dá)。

1.7細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位 爬片準(zhǔn)備，各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，固定，0.3% Triton破膜，1%BSA封閉，加入1%BSA稀釋的一抗(1∶100)，4℃孵育過夜，對(duì)照組用PBS代替一抗，加入1%BSA稀釋的二抗(1∶70)，染色，最后用熒光顯微鏡察看。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LXRα和LXRβ過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 取不同的MOI值(10、20、40、60)在不同時(shí)間(24、48、72、96 h)感染大鼠胚胎心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞，在熒光顯微連續(xù)鏡下察看，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞熒光表達(dá)增多，轉(zhuǎn)染24 h開始表達(dá)少量熒光，72 h熒光強(qiáng)度達(dá)最高峰；且最適MOI為40，見圖1，圖2。

2.2qRT-PCR檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞LXRα和LXRβ mRNA的表達(dá) 慢病毒感染72 h后，LXRα、LXRβ組mRNA表達(dá)(40.527±1.847，31.187±1.605)明顯升高(P<0.01)，而空載體組(1.000)與對(duì)照組(1.000)無(wú)明顯差別(P>0.05)，提示過表達(dá)LXRα、LXRβ病毒載體均轉(zhuǎn)染。

2.3CCK-8檢測(cè)LXRs過表達(dá)慢病毒對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響 高糖組增殖抑制率(47.67%±1.09%)顯著高于對(duì)照組(抑制率為0%作對(duì)照，P<0.01)；而與高糖組相比，LXRα組(11.08%±0.82%)和LXRβ組增殖抑制率(40.33%±1.32%)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且LXRα組降低更明顯(P<0.01)；空載體組(46.41%±1.12%)和高糖組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4qRT-PCR檢測(cè)MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組(表達(dá)量為1)相比，MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)在高糖組均明顯上調(diào)(P<0.01)；而在LXRα組和LXRβ組均顯著下調(diào)(P<0.05)，且LXRα組下調(diào)水平更明顯(P<0.01)；而高糖組與空載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5Western印跡檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，NF-κB p65磷酸化蛋白表達(dá)在高糖組明顯上升(P<0.01)；與高糖組相比，NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá)在LXRα組和LXRβ組均顯著下降(P<0.05)，且LXRα組下降更顯著(P<0.01)；而高糖組與空載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.6細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示大部分胞核表達(dá)較強(qiáng)的紅色熒光出現(xiàn)在高糖組(約75%)、空載體組(約75%)，而對(duì)照組胞核未見紅色熒光表達(dá)，LXRα組(約40%)和LXRβ(約68%)組表達(dá)紅色熒光。提示過表達(dá)LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而降低其活性。見圖4。

圖1 不同MOI值病毒感染H9C2細(xì)胞72 h熒光表達(dá)情況(×100)

圖2 MOI=40時(shí)H9C2細(xì)胞感染病毒熒光表達(dá)情況(×100)

表1 慢病毒感染后各組H9C2細(xì)胞MCP-1、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

圖3 Western印跡結(jié)果

圖4 慢病毒感染后各組H9C2細(xì)胞的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況(×100)

3 討 論

DCM是指糖尿病患者出現(xiàn)了異常的特異性心肌結(jié)構(gòu)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可以通過調(diào)節(jié)NF-κB等多種信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子分泌增加，導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生〔5〕。Wenzel等〔6〕體外研究顯示30 mmol/L葡萄糖能引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、心肌細(xì)胞P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)及活性氧簇(ROS)的形成，表明高糖與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高糖環(huán)境可使心肌細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

LXRs屬于核受體超家族成員，包含LXRα和LXRβ兩種亞型，其中LXRα主要分布在肝臟，而LXRβ遍布全身組織〔7〕。且已證實(shí)，LXRs激活后具有抗炎效應(yīng)，但其作用機(jī)制尚不明確，但已經(jīng)明確的抗炎機(jī)制包括有轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、反式阻抑，及調(diào)控脂質(zhì)代謝進(jìn)而抑制炎癥因子表達(dá)〔7〕。LXRs激活后可抑制環(huán)氧合酶(COX)-2、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9及其他一些促炎因子等表達(dá)，其機(jī)制為抑制NF-κB 和激活蛋白(AP)-1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步抑制脂多糖(LPS)介導(dǎo)的上述促炎因子的表達(dá)〔8〕。Xiao等〔9〕研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中，LXRs 活化后可負(fù)性調(diào)控炎癥應(yīng)答，其主要通過下調(diào)TNF-α、IL-1β 及IL-6等炎癥因子mRNA 的表達(dá)。

殷然等〔10〕在研究LXRs對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的影響，并進(jìn)一步研究其細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)，LXRs激動(dòng)劑T0901317預(yù)處理后，可顯著降低心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制與減輕心肌細(xì)胞A/R損傷引起的乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性升高，并顯著減少細(xì)胞炎癥因子釋放，進(jìn)一步抑制NF-κB信號(hào)通路活化。但Mitro等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動(dòng)劑T0901317在細(xì)胞和動(dòng)物中不但有LXR靶基因，還有異生素受體孕烷X受體(PXR)，其激活后產(chǎn)生結(jié)果不同，所以并不能將其結(jié)果都?xì)w因于LXRs。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖可激活NF-κB通路，而過表達(dá)LXRs(尤其是LXRα)可下調(diào)由高糖激活的NF-κB活性，同時(shí)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)也證實(shí)過表達(dá)LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而降低其活性。

綜上，炎癥反應(yīng)在DCM的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，而LXRs可通過抑制炎癥反應(yīng)來(lái)改善DCM的發(fā)生發(fā)展。Zhang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動(dòng)劑T0901317在發(fā)揮抗炎的同時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)LXRα活化引起的肝臟脂肪變性和高脂血癥。因此，很有必要尋求能避免引起肝脂肪變性和高脂血癥的特異性LXRs激動(dòng)劑。