放射性核素標(biāo)記HER2抗體和納米抗體的分子影像研究進(jìn)展

宋宏杰，周治國(guó)，宋少莉，王明偉

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海分子影像探針工程技術(shù)研究中心，上海 200032；

3. 復(fù)旦大學(xué)核物理與離子束應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；

4. 上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是酪氨酸激酶受體蛋白，已發(fā)現(xiàn)HER2高表達(dá)在許多癌癥類型中對(duì)細(xì)胞分化、增殖和預(yù)后起關(guān)鍵作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)：20%～30%的乳腺癌[2]，20%的胃癌或胃食管交界癌[3]，5%～15%的膀胱癌[4]，5%～15%的宮頸癌[5]，12%～15%的膽囊癌[6]，8%～35%的子宮內(nèi)膜癌[7]，6%～7%的卵巢癌[8]和15%～37%的唾液腺癌[9]HER2呈陽(yáng)性。因此，HER2表達(dá)檢測(cè)對(duì)于癌癥的診斷和治療非常重要，特別是具有定性/定量和全身顯像特點(diǎn)的HER2靶向性分子影像，能夠同時(shí)檢測(cè)原發(fā)灶、單/多轉(zhuǎn)移灶和治療過(guò)程中HER2表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。

為了發(fā)展有效的HER2分子影像檢查方法，包括抗體[10]、肽[11-12]和適配體[13-14]等在內(nèi)的HER2靶向性生物分子均有相關(guān)的研究報(bào)告。其中，曲妥珠單抗（trastuzumab，TzAb）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的一種人源化單克隆抗體，能夠結(jié)合HER2的細(xì)胞膜外區(qū)并抑制其功能[15]，基于該抗體的分子影像研究相對(duì)較多。然而，完整抗體的相對(duì)分子質(zhì)量較大（約150×103），導(dǎo)致血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，達(dá)到最佳顯像效果的時(shí)間通常在注射后3～7 d，臨床應(yīng)用有一定的局限性。納米抗體是天然存在的最小抗原結(jié)合片段，相對(duì)分子質(zhì)量小，僅為10×103～15×103，只是完整抗體的1/10，并且有穩(wěn)定性高、易于生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，在分子影像領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)逐漸興起[16-20]。本文主要綜述放射性核素標(biāo)記HER2完整抗體和納米抗體的分子影像探針及其單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）/電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET）/CT顯像的研究進(jìn)展。

1 基于高相對(duì)分子質(zhì)量HER2單克隆抗體的核素分子影像

至今各類放射性核素標(biāo)記靶向HER2的單克隆抗體已有很多研究。例如，64Cu[21-24]、18F[25-26]、89Zr[27-30]、99mTc[31-32]、111In[33-35]、131I[36-37]等核素標(biāo)記的TzAb和帕妥珠單抗（pertuzumab，PzAb）處子不同的研究階段，利用SPECT/CT或PET/CT顯像可在體內(nèi)檢測(cè)腫瘤組織HER2表達(dá)水平。

1.1 核素標(biāo)記TzAb及其SPECT/CT和PET/CT分子影像

TzAb是與HER2的細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域Ⅳ結(jié)合的重組人源化單克隆抗體[38]。放射性核素標(biāo)記TzAb的臨床前和臨床研究都已經(jīng)取得進(jìn)展，能夠使HER2陽(yáng)性腫瘤病灶顯像。為了利用SPECT/CT顯像HER2表達(dá)，Price等[33]將螯合劑p-SCN-Bn-H4octapa｛N，N’-[（羧酸基）甲基]-N，N’-[（6-羧酸基）吡啶（2-基）甲基]-1-（對(duì)芐基-異硫氰酸基）-1，2-二氨基乙烷｝與TzAb偶聯(lián)發(fā)展了新型HER2靶向抗體復(fù)合物H4octapa-Tz，并在溫和的條件下（15 min，室溫）實(shí)現(xiàn)了顯像核素111In和治療核素177Lu標(biāo)記，以較高的放射化學(xué)標(biāo)記率（94%～95%）獲得了111In-octapa-TzAb和177Lu-octapa-TzAb（圖1），研究者以SKOV-3卵巢癌移植瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，獲得了111In-octapa-TzAb和177Luoctapa-TzAb SPECT/CT圖像，均能清楚顯像腫瘤部位（圖1），二者分別于注射120和96 h后腫瘤攝取達(dá)到最大值[（72.4±21.3）%ID/g和（70.4±25.8）%ID/g]。該研究結(jié)果表明111In標(biāo)記TzAb的HER2表達(dá)SPECT/CT顯像具有很好的應(yīng)用前景。隨后，Gaykema等[35]報(bào)道TzAb治療中HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌111In-TzAb SPECT顯像具有可行性，發(fā)現(xiàn)治療后111In-TzAb的腫瘤攝取值明顯降低。

由于PET/CT顯像的優(yōu)勢(shì)更加明顯，利用半衰期較長(zhǎng)的正電子核素標(biāo)記TzAb PET/CT顯像HER2表達(dá)的研究更受關(guān)注。Tamura等[23]以DOTA為螯合劑，制備了核素64Cu標(biāo)記的HER2顯像探針64Cu-DOTA-TzAb，并開(kāi)展了HER2陽(yáng)性乳腺癌患者64Cu-DOTA-TzAb PET/CT顯像、安全性和內(nèi)輻射劑量研究，該研究發(fā)現(xiàn)，注射后48 h是評(píng)價(jià)腫瘤攝取64Cu-DOTA-TzAb的最佳時(shí)間點(diǎn)，而且獲得了乳腺癌原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶的高對(duì)比度的PET/CT顯像（圖2），其輻射劑量與常用的18F-FDG相當(dāng)，具有較好的安全性。

1.2 核素標(biāo)記帕妥珠單抗（pertuzumab，PzAb）及其SPECT/CT和PET/CT分子影像

如同TzAb一樣，PzAb是靶向HER2的另一種單克隆抗體，其結(jié)合于HER2的細(xì)胞膜外亞結(jié)構(gòu)域Ⅱ。放射性核素標(biāo)記PzAb及其HER2表達(dá)分子影像的臨床前和臨床研究同樣取得了良好的進(jìn)展。McLarty等[34]于2009年報(bào)道111In-DTPA-PzAb micro SPECT/CT顯像可靈敏地檢測(cè)乳腺癌模型HER2表達(dá)變化，研究者首先通過(guò)體外SKBR-3細(xì)胞飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)量111In-DTPAPzAb的Kd和Bmax分別為（2.0±1.0）nmol/L和（1.2±0.2）×106受體/細(xì)胞。MDA-MB-361腫瘤模型體內(nèi)micro SPECT/CT顯像表明，腫瘤部位顯像清晰，而且能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)TzAb治療后導(dǎo)致的HER2表達(dá)降低（圖3）。后來(lái)，他們又發(fā)展了用于制備111In-DTPA-PzAb的試劑盒，更加方便開(kāi)展相關(guān)的臨床研究[39]。

為了開(kāi)展基于PzAb的HER2表達(dá)PET/CT顯像研究，Jiang等[24]于2017年報(bào)道64Cu-DOTAPzAb micro PET可顯像卵巢癌HER2表達(dá)。他們選擇了3種卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3 和Caov3，開(kāi)展64Cu-DOTA-PzAb的體外細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其與SKOV3細(xì)胞具有高的特異度[Ka=（3.1±0.6）nmol/L]。進(jìn)一步micro PET顯像結(jié)果表明，注射后48 h，3種腫瘤組織的64Cu-DOTA-PzAb攝取值分別為（41.8±3.8）、（10.5±3.9）和（12.1±2.3）%ID/g，且能清晰檢查轉(zhuǎn)移灶（圖4）。2018年Ulaner等[30]報(bào)道89Zr-PzAb PET/CT可顯像乳腺癌患者體內(nèi)HER2表達(dá)，并首次開(kāi)展臨床應(yīng)用和輻射劑量研究，該研究入組了6例HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，注射89Zr-PzAb后均沒(méi)有毒性發(fā)生，全身平均有效劑量為（0.54±0.07）mSv/MBq。89Zr-PzAb的最佳顯像時(shí)間點(diǎn)為注射后5～8 d，其PET/CT顯像能夠檢查到多個(gè)HER2陽(yáng)性病灶和腦轉(zhuǎn)移灶（圖5）。

圖1 111In-octapa-TzAb（左）和177Lu-octapa-TzAb（右）SPECT/CT顯像及octapa-TzAb的結(jié)構(gòu)（中）

圖2 64Cu-DOTA-TzAb結(jié)構(gòu)和腫瘤患者PET/CT顯像

圖3 111In-DTPA-PzAb結(jié)構(gòu)和腫瘤模型SPECT/CT顯像

圖4 64Cu-DOTA-PzAb結(jié)構(gòu)和腫瘤模型PET/CT顯像

圖5 89Zr-PzAb結(jié)構(gòu)和腫瘤患者PET/CT顯像

2 基于低相對(duì)分子質(zhì)量HER2納米抗體的核素分子影像

基于納米抗體的腫瘤分子影像和診療應(yīng)用是新興研究領(lǐng)域，其中放射性核素標(biāo)記HER2納米抗體是非常活躍的一個(gè)研究領(lǐng)域。不同的放射性核素標(biāo)記的靶向HER2納米抗體及其應(yīng)用見(jiàn)表1。

表1 核素標(biāo)記HER2納米抗體與應(yīng)用

2.1 單光子核素標(biāo)記HER2納米抗體及其SPECT/CT分子影像

2.1.199mTc標(biāo)記HER2納米抗體及其SPECT/CT顯像

Vaneycken等[40]于2011年制備了靶向HER2的38種納米抗體，通過(guò)體外生化表征和細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)2Rs15d納米抗體穩(wěn)定性好，能選擇性與HER2蛋白和HER2陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)合，親和力為納摩爾水平，且與TzAb和PzAb不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，是HER2陽(yáng)性腫瘤的新型生物靶向分子。他采用[99mTc(H2O)3(CO)3]標(biāo)記2Rs15d的方法，獲得對(duì)應(yīng)的分子影像探針99mTc-2Rs15d。其HER2陽(yáng)性腫瘤模型的SPECT/CT顯像定量和生物分布分析表明，99mTc-2Rs15d腫瘤攝取高，血液清除快，非靶器官積累低（腎臟除外）。注射后1 h，腫瘤/血液（T/B）與腫瘤/肌肉（T/M）的比值均已很高，腫瘤顯像對(duì)比度清晰（圖6）。

2.1.2111In標(biāo)記HER2納米抗體及其SPECT/CT顯像

位點(diǎn)特異度標(biāo)記是發(fā)展基于抗體的分子影像探針的挑戰(zhàn)和難點(diǎn)，納米抗體也面臨同樣的問(wèn)題。Massa等[43]于2014年通過(guò)硫醚鍵方法開(kāi)發(fā)了位點(diǎn)特異度標(biāo)記納米抗體的通用策略，研究者在他們前期研究HER2納米抗體的基礎(chǔ)上，選擇His標(biāo)簽化2Rs15d（2Rs15d-H）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，為了避免干擾抗原結(jié)合能力，在其羧基端依次引入連接子（Linker）和半胱氨酸（Cys）構(gòu)建新的衍生物2Rs15d-HLC。在溫和的還原劑存在條件下，他們進(jìn)一步將2Rs15d-HLC與含有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的螯合劑maleimide-DTPA螯合，實(shí)現(xiàn)了核素111In標(biāo)記，得到新的SPECT/CT顯像探針111In-DTPA-2Rs15d-HLC，并與隨機(jī)標(biāo)記得到的111In-CHX-A″-DTPA-2Rs15d-H進(jìn)行比較。體外生化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)表明， DTPA-2Rs15d-HLC的化學(xué)組分單一，結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量明確，與HER2的親和力保持在納摩爾水平。其體內(nèi)HER2陽(yáng)性SKOV3腫瘤SPECT/CT顯像顯示，腫瘤組織吸收高，肝、肺等正常組織攝取值較低，體內(nèi)穩(wěn)定性良好（圖7）。

圖6 99mTc-2Rs15d的標(biāo)記反應(yīng)和腫瘤模型SPECT/CT顯像

圖7 111In-DTPA-2Rs15d-HLC的結(jié)構(gòu)和腫瘤模型SPECT/CT顯像

2.2 正電子核素標(biāo)記HER2納米抗體及其PET/CT分子影像

2.2.168Ga標(biāo)記HER2納米抗體及其PET/CT顯像

核素68Ga可以通過(guò)68Ge/68Ga發(fā)生器獲得，來(lái)源較為便利，同時(shí)半衰期短（t1/2=68 min），適用于標(biāo)記多肽和納米抗體等血液清除快、相對(duì)分子質(zhì)量小的靶向性生物分子，與其相關(guān)的PET/CT顯像報(bào)道越來(lái)越多。前文講述的納米抗體2Rs15d結(jié)構(gòu)中均含有His6標(biāo)簽，它是為了便于分離純化而在生產(chǎn)期間引入的。然而，對(duì)于人體內(nèi)應(yīng)用，這些富含組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白可能存在免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)[49-50]，需要考慮去掉His6標(biāo)簽。Xavier等[46]于2013年報(bào)道，納米抗體2Rs15dHis6和2Rs15d與螯合劑NOTA連接后，可以實(shí)現(xiàn)快速高效的68Ga標(biāo)記，生成HER2表達(dá)PET/CT顯像探針68Ga-NOTA-2Rs15dHis6和68Ga-NOTA-2Rs15d。在pH為5的條件下，室溫反應(yīng)5 min，它們的標(biāo)記率達(dá)到97%以上，比活度為55～200 MBq/nmol。生物分布研究顯示，這兩種探針均能快速、特異地積聚于HER2陽(yáng)性腫瘤部位，其注射后1 h腫瘤攝取值分別為（3.13±0.06）和（4.34±0.90）%ID/g，并有很高的腫瘤/血液（T/B）和腫瘤/肌肉（T/M）的比值，因而獲得高對(duì)比度PET/CT圖像（圖8）。該研究報(bào)道了兩個(gè)非常重要的發(fā)現(xiàn)：不含His6標(biāo)簽的探針68Ga-NOTA-2Rs15d的腎臟攝取減少60%；注射抗體的質(zhì)量顯著改變其整體的生物分布，即NOTA-2Rs15d的質(zhì)量增加100倍，肝臟攝取值從（7.43±1.89）%ID/g降低到（2.90±0.26）%ID/g，而腫瘤攝取值從（2.49±0.68）增加到（4.23±0.99）%ID/g。

隨后不久，該課題組就開(kāi)展了68Ga-2Rs15d PET/CT顯像檢測(cè)乳腺癌患者HER2表達(dá)的Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究[17]。該項(xiàng)臨床研究入組22例HER2評(píng)分2+或3+的原發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，注射53～174 MBq68Ga-2Rs15d后進(jìn)行PET/CT顯像。研究結(jié)果表明，所有患者均沒(méi)有發(fā)生不良反應(yīng)，68Ga-2Rs15d的血液清除較快，注射1 h后血液的放射性活度只有注射量的10%，正常組織器官的吸收主要見(jiàn)于腎臟、肝臟和小腸，有效劑量為0.043 mSv/MBq，平均每人的吸收劑量為4.6 mSv。68Ga-2Rs15d PET/CT顯像可以檢測(cè)腫瘤組織（圖9），該探針在原發(fā)腫瘤的積聚變化范圍較大，而在轉(zhuǎn)移性腫瘤組織的積聚都在本底之上，其臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖8 68Ga-NOTA-2Rs15d的結(jié)構(gòu)和腫瘤模型PET/CT顯像

圖9 腫瘤患者68Ga-NOTA-2Rs15d PET/CT顯像

2.2.218F標(biāo)記HER2納米抗體及其PET/CT顯像

18F由醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)，獲得便利，產(chǎn)量較高，半衰期（t1/2=109.7 min）合適，已有多樣化的標(biāo)記方法，是目前用于PET/CT顯像最廣泛的正電子核素。18F標(biāo)記的PET顯像探針在臨床和臨床前分子影像領(lǐng)域均是最有代表性的、最成功的應(yīng)用，特別是18F-FDG PET/CT的普及，18F標(biāo)記HER2顯像探針自然會(huì)成為重要的研究方向。在前期工作的基礎(chǔ)上，Xavier等[48]采取最常用的18F標(biāo)記輔基18F-SFB與納米抗體2Rs15d偶聯(lián)的方法，制備得到HER2顯像探針18F-FB-2Rs15d，開(kāi)展了其體內(nèi)生物分布和腫瘤顯像研究。18F-FB-2Rs15d的放射化學(xué)產(chǎn)率為5%～15%（衰變校正之后），比活度為（24.7±8.2）MBq/nmol。體內(nèi)生物分布和PET/CT顯像實(shí)驗(yàn)表明，該探針腎臟清除快，在HER2陽(yáng)性腫瘤內(nèi)高特異度積聚，注射1和3 h后腫瘤攝取分別為（25.94±1.17）和（3.74±0.52）%ID/g，進(jìn)而獲得高對(duì)比度的腫瘤圖像（圖10）。與此同時(shí)，Vaidyanathan等[47]報(bào)道了18F標(biāo)記另一種HER2靶向納米抗體5F7的臨床前評(píng)價(jià)研究，研究者利用兩種18F標(biāo)記方法，即兩種輔基18F-SFB和18F-RL-I分別與5F7偶聯(lián)，制備對(duì)應(yīng)的PET顯像探針18F-FB-5F7和18F-RL-I-5F7，評(píng)價(jià)其體內(nèi)外生物學(xué)性質(zhì)和顯像效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，18F-RL-I-5F7在HER2陽(yáng)性細(xì)胞中內(nèi)化程度高于18F-FB-5F7，注射1和2 h后前者在BT474M1腫瘤內(nèi)攝取值分別為（28.97±3.88）和（36.28±14.1）%ID/g，顯著高于后者，然而，前者在腎臟內(nèi)分布是后者的28～36倍。同時(shí)，18F-RL-I-5F7 PET/CT可以清晰顯像HER2陽(yáng)性腫瘤，并能被TzAb阻斷，說(shuō)明其HER2特異性（圖10）。

圖10 18F-FB-2Rs15d和18F-RL-I-5F7結(jié)構(gòu)和腫瘤模型PET/CT顯像

3 結(jié)論和展望

核素分子影像即SPECT/CT和PET/CT顯像在腫瘤精準(zhǔn)診斷和治療中的作用越來(lái)越重要。因此，本文綜述了核素標(biāo)記HER2完整抗體和納米抗體的分子影像探針及其HER2陽(yáng)性腫瘤SPECT/CT和PET/CT顯像的研究進(jìn)展。HER2抗體TzAb和PzAb均是成功的臨床藥物，臨床上體內(nèi)HER2表達(dá)顯像的需求非常明確，與之相應(yīng)，核素標(biāo)記TzAb和PzAb開(kāi)始較早，有關(guān)的SPECT/CT和PET/CT顯像的臨床試驗(yàn)較多，臨床應(yīng)用前景很好。特別是隨著半衰期較長(zhǎng)的新型正電子核素64Cu和89Zr的出現(xiàn)，更加有利于基于HER2抗體的PET/CT顯像的臨床轉(zhuǎn)化研究和應(yīng)用。然而，其最佳腫瘤顯像時(shí)間是注射后3～5 d，這是其主要的局限性。與之相比，基于納米抗體的藥物尚處于臨床試驗(yàn)和初期應(yīng)用階段，相應(yīng)的核素標(biāo)記HER2納米抗體的研究起步較晚。由于相對(duì)分子質(zhì)量小、血液清除快，核素標(biāo)記HER2納米抗體具有注射后“1 d內(nèi)”及時(shí)顯像的特別優(yōu)勢(shì)，因此其臨床前和臨床研究的進(jìn)展較快，均已取得積極的結(jié)果。需要指出的是，HER2納米抗體的生物半衰期與核素68Ga和18F的物理半衰期較為匹配，再加上PET/CT顯像的固有優(yōu)勢(shì)，68Ga和18F標(biāo)記HER2納米抗體的研究越來(lái)越受到關(guān)注?？偟膩?lái)說(shuō)，核素標(biāo)記HER2完整抗體和納米抗體均已呈現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景，將為臨床上在體內(nèi)檢測(cè)HER2表達(dá)提供有效的核素顯像探針。