苦杏仁苷脂質(zhì)體的制備及特性研究

劉瑞霞，潘 麗，丁冬有

1.鄭州師范學院 生命科學學院，河南 鄭州 450044 2.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 3.鄭州企鵝糧油機械有限公司，河南 鄭州 450001

苦杏仁苷又名維生素B17，是傳統(tǒng)中藥苦杏仁、桃仁和枇杷等的有效成分，具有止咳定喘、退熱和止渴的功效[1-2]，同時具有抗肝細胞纖維化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎及抗腫瘤等生物功能[3-6]。然而，苦杏仁苷極性大、親水性強以及油水分配系數(shù)小，存在跨膜吸收障礙[7]，極大限制了其在食品、保健品以及藥品領域的應用。

脂質(zhì)體是指由脂質(zhì)分子構成，具有與生物膜類似的雙分子層結構的囊泡[8-9]。磷脂分子是構成脂質(zhì)體的膜材，屬于非離子型表面活性劑，結構中含有一個親水性的頭基和兩個疏水性的尾基[10]?；谥|(zhì)體的結構，其作為運輸載體最顯著的優(yōu)勢是具有既親水又親油的性質(zhì)，不但能包埋脂溶性物質(zhì)，還可以包埋水溶性物質(zhì)[11]。作為最具應用潛力的載體之一，脂質(zhì)體可有效促進水溶性功能因子的吸收，提高生物利用率，并且改善靶向性和緩釋效果[12-15]。作者利用逆向蒸發(fā)法將苦杏仁苷包埋到脂質(zhì)體中，制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，確定最優(yōu)的制備工藝條件，并考察其物化性質(zhì)、儲藏穩(wěn)定性和體外釋放特性，以提高苦杏仁苷的脂溶性、穩(wěn)定性、生物利用率以及緩釋效果，拓寬苦杏仁苷的應用范圍，并為進一步開發(fā)新型輸送載體提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁苷(純度98%)：陜西信瑞生物科技有限公司；大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量大于98%)：沈陽天峰生物制藥有限公司；膽固醇(純度>95%)：阿拉丁試劑(上海)有限公司；磷酸二氫鈉、鹽酸：洛陽昊華化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉：西隴化工股份有限公司；乙醚：洛陽市化學試劑廠；硫代巴比妥酸：廣東省化學試劑工程技術研究中心；三氯乙酸：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HN-50超聲波材料乳化分散器：上海汗諾儀器有限公司；RE-52 A型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Zetasizer Nano-ZS型納米粒度分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；2695-2998高效液相色譜儀：美國Waters公司；超濾離心管：美國Millipore公司(MWCO為10 kDa)；HT7700型透射電子顯微鏡：日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜法測定苦杏仁苷含量

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)=3∶7；流速：1 mL/min；檢測波長：215 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.1.2 苦杏仁苷標準曲線的繪制

稱取一定量的苦杏仁苷標準品，用流動相做溶劑，定容于100 mL容量瓶中，配制苦杏仁苷標準溶液。分別量取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mL苦杏仁苷標準溶液，定容于5 mL容量瓶中，搖勻、靜置。利用高效液相色譜法測定苦杏仁苷的含量，以苦杏仁苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=8 355 194.141 5x+13 855.178，R2=0.999 8。

1.3.2 苦杏仁苷脂質(zhì)體的制備

取一定量的大豆磷脂酰膽堿和膽固醇，用一定體積的乙醚溶解，另取一定量的苦杏仁苷用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分溶解，并將苦杏仁苷溶液倒入大豆磷脂酰膽堿與膽固醇混合溶液中，利用超聲波乳化分散器超聲5 min(1 s開，1 s停)，得到的乳液置于100 mL圓底燒瓶中旋轉蒸發(fā)30 min左右，除去有機溶劑，加入5 mL含一定量吐溫-80的PBS進行水合，制備得到的苦杏仁苷脂質(zhì)體在4 ℃下儲存。

1.3.3 苦杏仁苷脂質(zhì)體包封率的測定

移取一定量的苦杏仁苷脂質(zhì)體溶液于超濾離心管中，16 000 r/min 下冷凍高速離心30 min，吸取400 μL濾液備用。同時吸取 400 μL未經(jīng)超濾的苦杏仁苷脂質(zhì)體，加入800 μL甲醇中并超聲5 min進行破乳。濾液和破乳樣品用甲醇稀釋至相同倍數(shù)，利用0.22 μm濾膜過濾后進行高效液相色譜檢測，分別得到脂質(zhì)體中游離苦杏仁苷和總苦杏仁苷的質(zhì)量?？嘈尤受罩|(zhì)體的包封率計算公式如下：

式中：M總為破乳后脂質(zhì)體中苦杏仁苷的總質(zhì)量(mg)；M游為游離苦杏仁苷的質(zhì)量(mg)。

1.3.4 苦杏仁苷脂質(zhì)體粒徑及分布和zeta電位的測定

利用粒度分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑及分布和zeta電位，測定溫度為25 ℃，準確移取400 μL樣品，用蒸餾水稀釋200倍，每一個樣品測量3次,取平均值。

1.3.5 苦杏仁苷脂質(zhì)體的微觀形貌

1 mL樣品用PBS(pH 7.4)稀釋2倍，吸取少許溶液滴到附有碳膜的銅網(wǎng)上，10 min后用濾紙吸去剩余的液體，然后滴上磷鎢酸(2%)進行染色，大約5 min后用濾紙吸去多余的染色液，室溫下無塵風干后用透射電子顯微鏡進行觀察。

1.3.6 苦杏仁苷脂質(zhì)體膜氧化性的測定

取30 g三氯乙酸和0.75 g硫代巴比妥酸(TBA)加入200 mL鹽酸溶液(0.25 mol/L)，微熱溶解作為TBA溶液。稱取0.2 g丁基對苯二酚，用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中待用。取5 mL TBA溶液和1 mL脂質(zhì)體溶液混合于10 mL試管中，加入1 mL的丁基對苯二酚溶液(為防止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與TBA加熱時分解成可與TBA反應的物質(zhì))，沸水浴30 min，迅速取出在自來水中冷卻，然后5 000 r/min下離心10 min，取上清液在532 nm處測定吸光值。

1.3.7 苦杏仁苷脂質(zhì)體儲藏穩(wěn)定性的研究

將制備好的苦杏仁苷脂質(zhì)體等質(zhì)量分裝在帶有螺旋蓋的棕色樣品瓶中，分別于4 ℃、25 ℃條件下，避光、充氮氣保存25 d，每5 d測定其粒徑及分布、保留率以及脂質(zhì)體膜氧化性的變化，按下式計算保留率。

式中：M1為儲藏一段時間后脂質(zhì)體包埋苦杏仁苷的質(zhì)量(mg)；M2為脂質(zhì)體初始包埋苦杏仁苷的質(zhì)量(mg)。

1.3.8 苦杏仁苷脂質(zhì)體體外釋放特性的研究

以PBS (pH 7.4)作為釋放介質(zhì)，考察苦杏仁苷脂質(zhì)體的釋放特性。10 mL 苦杏仁苷脂質(zhì)體或苦杏仁苷溶液加入分子質(zhì)量為10 kDa透析袋中，然后將密封的透析袋浸沒在50 mL 的釋放介質(zhì)中(溫度為 37 ℃±0.5 ℃，攪拌速度為 100 r/min)，在預先設定的時間 (0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h)分別取1 mL透析袋外樣品，并補充等量預熱到37 ℃的新鮮緩沖溶液，通過上述方法測定苦杏仁苷的質(zhì)量，每個樣品平行測定3次，苦杏仁苷累積釋放率按下式計算：

式中：Mn為某一時刻n釋放的苦杏仁苷質(zhì)量(mg)；M為總苦杏仁苷的質(zhì)量(mg)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個試驗平行測定3次，結果取平均值。采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS 23.0軟件進行方差分析， Duncan 法(P<0.05)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

pH值、磷脂與膽固醇質(zhì)量比、有機相與水相體積比、苦杏仁苷與磷脂質(zhì)量比對包封率的影響見圖1。

2.1.1 PBS的pH值對脂質(zhì)體包封率的影響

固定其他因素，分別以PBS的pH值為6.2、6.6、7.0、7.4、7.8制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，研究pH值對包封率的影響。由圖1a可知，pH值從6.2增加到6.6時，包封率從16.78%增加到27.82%。另外，當pH值繼續(xù)增大到7.8時，包封率降低。這可能是由于磷脂的水解常數(shù)與環(huán)境的pH值密切相關，在強酸或者強堿環(huán)境中，磷脂的水解常數(shù)增加，水解速率增大，從而影響脂質(zhì)體的包封率。pH值接近中性時，磷脂的水解速率降低，利于脂質(zhì)體體系的穩(wěn)定。因此，pH值為6.6時脂質(zhì)膜的滲漏率最低，包封率最大，達到27.82%。

2.1.2 磷脂與膽固醇質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響

固定其他因素，分別以磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(脂膽比)為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1和6∶1制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，研究脂膽比對包封率的影響。由圖1b可知，隨著脂膽比的增大，包封率先增大后減小，當脂膽比為4∶1時，包封率最大，達到23.96%。膽固醇可以嵌入到脂質(zhì)雙分子層膜中，通過對膜流動性的調(diào)節(jié)提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。當膽固醇濃度較低時，脂質(zhì)雙分子層膜致密度小，流動性大，包埋的芯材容易滲漏；然而，膽固醇濃度過高時，嵌入磷脂雙分子層膜的膽固醇量增加，導致空間較小，膜剛性增大，故包封率降低[16]。

注：a、b、c、d分別為pH值、脂膽比、有機相與水相比、藥脂比對包封率的影響。圖1 單因素對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.1 Effect of single factor on encapsulation efficiency

2.1.3 有機相與水相體積比對脂質(zhì)體包封率的影響

固定其他因素，分別以有機相與水相體積比(有機相與水相比)為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，研究有機相與水相比對包封率的影響。由圖1c可知，隨著有機相與水相比的增大，包封率先增大后減小，當有機相與水相比為3∶1時，包封率最大，達到24.65%。這可能是因為有機相的量過小時，不能完全將磷脂等膜材全部溶解，導致包封率不高；而當大量的有機相存在時，會對脂質(zhì)體的膜結構造成一定的破壞，包封率降低。

2.1.4 苦杏仁苷與磷脂質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響

固定其他因素，分別以苦杏仁苷與磷脂質(zhì)量比(藥脂比)為5%、10%、15%、20%和25%制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，考察藥脂比對包封率的影響。由圖1d可知，藥脂比為5%時，苦杏仁苷脂質(zhì)體的包封率最大，達到28.51%。隨著藥脂比的增加，包封率逐漸減小。當藥脂比大于20%時，包封率基本不再變化。這說明脂質(zhì)體囊泡空間是有限的，對芯材的包埋具有飽和性。隨著芯材加入量的增大，包封率會減小，當芯材總量超過磷脂雙分子層膜的飽和值后，包封率將不再變化。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗，選擇藥脂比為5%，通過正交試驗考察脂膽比、有機相與水相比及PBS的pH值3個因素對脂質(zhì)體包封率的影響，以確定制備苦杏仁苷脂質(zhì)體的最佳工藝條件，結果見表1。

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal test design and results

由表1可知，各因素對包封率的影響主次順序：pH值>有機相與水相比>脂膽比，最佳工藝條件為A2B1C2，即脂膽比為4∶1，有機相與水相比為2∶1，pH值為6.6。

采用優(yōu)化后的工藝條件進行驗證試驗，平行制備3個樣品，平均包封率為(33.42±1.76)%，優(yōu)于正交試驗中的任何一個組合，因此確定最優(yōu)制備工藝條件：脂膽比4∶1，有機相與水相比2∶1，pH值6.6，藥脂比5%。

2.3 苦杏仁苷脂質(zhì)體物化性質(zhì)的研究

制備的苦杏仁苷脂質(zhì)體在最優(yōu)工藝條件下的包封率為(33.42±1.76)%，平均粒徑為(189.7±1.3) nm，多相分散指數(shù)(polyphase dispersion index，PDI)為0.16±0.02，粒徑分布如圖2所示，苦杏仁苷脂質(zhì)體粒徑分布相對較窄，表現(xiàn)為均一的分散。這可能歸因于超聲處理的強器械作用有效減小了苦杏仁苷脂質(zhì)體的粒徑，同時使得苦杏仁苷脂質(zhì)體囊泡具有更好的分散性?？嘈尤受罩|(zhì)體的zeta電位為(-31.2±2.41) mV，表明構建的脂質(zhì)體具有足夠的表面電荷抑制粒子間的聚集。這可能由于苦杏仁苷分子的極性羥基與磷脂極性頭基的膽堿相互作用，產(chǎn)生的偶極子取向增加了脂質(zhì)體的表面負電荷[17]。

圖2 苦杏仁苷脂質(zhì)體粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of amygdalin-loaded liposomes

圖3 苦杏仁苷脂質(zhì)體透射電子顯微鏡圖Fig.3 Transmission electron micrograph of amygdalin-loaded liposomes

采用透射電子顯微鏡觀察苦杏仁苷脂質(zhì)體微觀形貌，結果見圖3，苦杏仁苷脂質(zhì)體囊泡外觀形貌呈較規(guī)則球狀，分散性好，粒徑大約為190 nm，與粒度分析儀測定結果是一致的。

2.4 苦杏仁苷脂質(zhì)體儲藏穩(wěn)定性的研究

苦杏仁苷脂質(zhì)體分別在4 ℃、25 ℃條件下避光、充氮氣儲藏，研究儲藏過程中脂質(zhì)體的粒徑大小及分布、保留率、膜氧化性的變化，結果見圖4。

由圖4a可知，不同儲藏條件下脂質(zhì)體的粒徑均隨著儲藏時間的延長不同程度地增大，4 ℃儲藏25 d后脂質(zhì)體的粒徑只有較小的變化，而25 ℃儲藏25 d后脂質(zhì)體的粒徑增加到669 nm。由圖4b可知，4 ℃和25 ℃儲藏條件下苦杏仁苷脂質(zhì)體的多相分散指數(shù)均隨著儲藏時間的延長而增大，同時可以看出脂質(zhì)體的多相分散指數(shù)在4 ℃儲藏25 d后只增加了1倍，而25 ℃條件下快速增加了近3倍。相比25 ℃，4℃條件下儲藏的脂質(zhì)體表現(xiàn)出更小的多相分散指數(shù)。

保留率直接反映了脂質(zhì)體中芯材的有效含量隨儲藏時間的變化，是評價脂質(zhì)體對包埋的芯材保護能力的重要指標之一。從圖4c可以看出，不同儲藏條件下脂質(zhì)體中的苦杏仁苷的保留率均隨著儲藏時間的延長而減小。在4 ℃和25 ℃條件下儲藏25 d后脂質(zhì)體的保留率分別下降至73.01% 和50.22%。由此可見，脂質(zhì)體具有較強的保護包埋苦杏仁苷的能力，并且4 ℃比25 ℃條件下儲藏保留能力更強。這是由于儲藏溫度的升高促進磷脂的水解，而磷脂的水解和氧化作用會改變脂質(zhì)體的結構，從而導致包埋的苦杏仁苷滲漏。

脂質(zhì)在儲藏過程中會氧化生成丙二醛，然后與硫代巴比妥酸發(fā)生成色反應，測定丙二醛相對含量的變化，可間接了解脂質(zhì)體氧化的程度。脂質(zhì)體被氧化程度越大，丙二醛含量越高，顏色越深，利用紫外分光光度儀在532 nm處測定的吸光度越大[18]。由圖4d可知，4 ℃條件下儲藏的苦杏仁苷脂質(zhì)體吸光度在儲藏期內(nèi)變化不大，而25 ℃條件下吸光度呈上升趨勢。說明苦杏仁苷脂質(zhì)體低溫下保持較好的氧化穩(wěn)定性，而儲藏溫度較高會加速磷脂氧化，吸光度升高。

2.5 苦杏仁苷脂質(zhì)體體外釋放特性的研究

以苦杏仁苷溶液作為對照，PBS為釋放介質(zhì)，考察苦杏仁苷脂質(zhì)體的體外釋放特性，結果見圖5。前2 h內(nèi)苦杏仁苷溶液快速釋放，釋放率超過65%，12 h時的釋放率達到90%以上。與苦杏仁苷溶液相比，脂質(zhì)體包埋能夠顯著地減小苦杏仁苷的釋放速率，前2 h苦杏仁苷的釋放率僅為5.94%，12 h內(nèi)脂質(zhì)體包埋的苦杏仁苷釋放率小于22%，后期進入一個緩慢釋放的過程，24 h苦杏仁苷釋放率也僅為23.55%。由此可見，苦杏仁苷脂質(zhì)體表現(xiàn)出持續(xù)的釋放特性，原因可能是很大一部分的苦杏仁苷被包裹在脂質(zhì)體的水相里，構成脂質(zhì)體的磷脂雙分子層的阻礙，抑制了苦杏仁苷從磷脂雙分子層爆發(fā)性地釋放出來，使得苦杏仁苷緩慢釋放。同時，脂質(zhì)體不同的緩釋性是由于不同的包封率與膜結構所致。因此，脂質(zhì)體的包封率和膜結構都是影響其緩釋效果的重要因素[19]。

注：a、b、c、d分別為粒徑、PDI、保留率和膜氧化性的變化。圖4 4 ℃和25 ℃條件下儲藏苦杏仁苷脂質(zhì)體粒徑、多相分散指數(shù)、保留率和膜氧化性的變化Fig.4 Changes of particle size, PDI, retention rate, and membrane oxidability of amygdalin-loaded liposomes stored at 4 ℃ and 25 ℃

圖5 苦杏仁苷脂質(zhì)體和苦杏仁苷溶液在釋放介質(zhì)中的體外釋放曲線Fig.5 In vitro release profiles of amygdalin-loaded liposomes and amygdalin solution in release media

3 結論

利用逆向蒸發(fā)法制備苦杏仁苷脂質(zhì)體，通過單因素試驗，考察PBS的pH值、脂膽比、有機相與水相比及藥脂比對脂質(zhì)體包封率的影響，然后進行正交試驗。確定最優(yōu)制備工藝條件：脂膽比4∶1，有機相與水相比2∶1，PBS的pH值6.6，藥脂比5%。在此條件下，得出包封率為(33.42±1.76)%。通過動態(tài)光散射法測定，苦杏仁苷脂質(zhì)體平均粒徑為(189.7±1.3) nm，多相分散指數(shù)為0.16±0.02，zeta電位為(-31.20±2.41) mV。通過透射電子顯微鏡觀察苦杏仁苷脂質(zhì)體的微觀形貌，苦杏仁苷脂質(zhì)體囊泡呈規(guī)則的球體，分布均勻。研究了苦杏仁苷脂質(zhì)體在儲藏期的粒徑大小及分布、保留率、膜氧化程度的變化，結果表明溫度影響較大，苦杏仁苷脂質(zhì)體具有較好的儲藏穩(wěn)定性。另外，體外釋放試驗結果表明，脂質(zhì)體包埋可有效降低苦杏仁苷的釋放速率，具有良好的緩釋性。本研究制備了高效和穩(wěn)定的苦杏仁苷脂質(zhì)體，拓寬了苦杏仁苷的應用范圍，并為進一步開發(fā)苦杏仁苷新劑型提供理論指導。