基于核酸適體檢測黃曲霉毒素B1的方法與高效液相色譜法的對比研究

付少偉，謝巖黎，班 珺

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室,河南 鄭州 450001

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是由黃曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等產(chǎn)生的一類含有二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物[1]，其中黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)因具有致癌性、致毒性和致突變性[2-4]，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為人類第一類致癌物[5-7]。黃曲霉毒素B1主要分布在大米、花生、玉米、小麥和大豆等農(nóng)作物中，污染可發(fā)生在生長、收獲、運輸、儲藏等多個環(huán)節(jié)[8]。我國規(guī)定人食用的玉米及其制品中AFB1含量不能超過20 μg/kg，小麥、大麥等其他谷物中AFB1含量不能超過5 μg/kg[9]，歐盟規(guī)定谷物及其制品、花生、堅果及其加工制品中AFB1含量不能超過20 μg/kg[10]。

長期以來，科研工作者為AFB1的檢測探索了許多方法，如薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)、膠體金免疫層析技術(shù)(Immune colloidal gold technique，GICT)、液質(zhì)聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)[9,11-12]。高效液相色譜法是檢測真菌毒素最常用的檢測技術(shù)，以液體作為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器，從而實現(xiàn)對試樣的分析。Rodriguez-carrasco等[13]通過建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶樣品中黃曲霉毒素的含量，結(jié)果顯示該方法檢測限和定量限分別為0.001、0.002 μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7%，在0.005、0.01、0.05 μg/L的加標(biāo)水平下，回收率為75%～96%。王督等[14]利用高效液相色譜對不同激發(fā)波長、發(fā)射波長、流動相等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為360、440 nm，流動相為水-甲醇(體積比為65∶35)時玉米中黃曲霉毒素檢測分離效果最佳。高效液相色譜法檢出限低、重現(xiàn)性好、靈敏度高，但凈化后的樣品需進(jìn)一步衍生，樣品預(yù)處理操作繁瑣、儀器昂貴、成本較高，不適合大批量檢測及現(xiàn)場檢測[9]。

核酸適配體(核酸適體)1990年由Ellington等[15-16]提出，是采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[17]從體外人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸片段[18-19]，與抗體相比，適配體具有生產(chǎn)方便、成本低、熱穩(wěn)定好、易化學(xué)合成、易與多種官能團(tuán)修飾、高親和合力和高特異性等優(yōu)點[20-21]，在診斷、治療、檢測等領(lǐng)域成為重要工具,同時為生物毒素的分析檢測開辟了新道路?；谶m配體的以上優(yōu)點，作者將建立的酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與目前檢測AFB1最廣泛使用的高效液相色譜法進(jìn)行比較，對比檢出限、線性范圍、樣品回收率，分析適用情況，為探索黃曲霉毒素B1的快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉毒素B1(AFB1)：Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇(色譜純)：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；氯化鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；高純氮(含量≥99.999%)：河南科益氣體工程有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；玉米、花生：市購。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜、2475 HPLC FLR多波長熒光檢測器：美國Waters公司；光化學(xué)衍生器、黃曲霉毒素B1免疫親和柱：月旭材料科技(上海)有限公司；玻璃纖維濾紙：上海優(yōu)譽(yù)儀器儀表有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀(上海)有限公司；FW-80高速萬能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；KQ100-E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DL-5-B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；MTN-2800D氮吹濃縮裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶聯(lián)適體法檢測AFB1

參考Xie等[22]建立的酶聯(lián)適體法，用PBS結(jié)合緩沖液將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、20、40、60、80、100 ng/mL，在優(yōu)化好的檢測體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。向酶標(biāo)板依次加入鏈霉親和素、牛血清蛋白、核酸適體(5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′)、核酸適體互補(bǔ)鏈(5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′)并充分反應(yīng)后，加入一系列不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液，37 ℃溫育1 h使AFB1與AFB1核酸適體發(fā)生特異性緊密結(jié)合，從而迫使互補(bǔ)鏈從核酸適體上脫落。隨后甩干酶標(biāo)板并用PBST將脫落的互補(bǔ)鏈及過剩的AFB1洗脫，加入HRP-SA，37 ℃溫育1 h后分別加入TMB顯色，加入1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀雙波長法測A450/620，觀察不同濃度AFB1使檢測體系發(fā)生的顏色變化及A450/620變化，建立酶聯(lián)適體法檢測AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以20 mL乙腈-水(體積比為85∶15)為提取液，高速均質(zhì)5 min，4 000 r/min離心5 min后取4 mL上清液，氮吹儀吹干提取液，加入1 mL PBS工作液復(fù)溶，使待測液中AFB1質(zhì)量濃度分別為5、20、60 ng/mL。采用優(yōu)化好的標(biāo)準(zhǔn)品檢測方法對其進(jìn)行檢測，并計算回收率。

1.3.2 適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測AFB1

參考班珺等[11]建立的適體轉(zhuǎn)換熒光法，以PBS為工作液，選擇最佳適體鏈，以Tris-HCl為工作液測定檢測系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率。通過(F-F0)/F0求熒光增長率，其中F0為猝滅狀態(tài)時的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入毒素后的熒光強(qiáng)度。用PBS緩沖液將核酸適體(5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-FAM -3′)、猝滅鏈(5′-BHQ1-TGTGGGCCTAGCG-3′)配置成200 nmol/L，將AFB1母液稀釋成0、0.1、1、10、50、100、200、300 ng/L，在優(yōu)化好的檢測體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。400 μL 200 nmol/L核酸適體與400 μL 200 nmol/L猝滅鏈反應(yīng)30 min后，將800 μL一系列不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液加入反應(yīng)體系，反應(yīng)1 h后測定熒光強(qiáng)度，以AFB1濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用優(yōu)化好的檢測方法測定樣品的初始濃度C0?；厥赵囼炛?，向樣品分別加入5、20、60 μg/kg的AFB1，加標(biāo)后的檢測濃度為C1，以(C1-C0)/加標(biāo)濃度計算回收率。

1.3.3 高效液相色譜法檢測AFB1

參照LS/T 6128—2017《糧油檢驗 糧食中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定超高效液相色譜法》配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行樣品提取及加標(biāo)，最后將樣品凈化后進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用統(tǒng)計學(xué)的分析方法將酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測AFB1進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，每個樣品測定3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測AFB1

采用高效液相色譜法檢測AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=1 135 950x-196 298.771 82(R2=0.999 6)，線性范圍為0.1～100 ng/mL，檢出限為0.1 ng/mL。采用高效液相色譜法對花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表1和表2，花生中AFB1回收率為80.00%～92.40%，玉米中AFB1回收率為74.97%～102.05%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，效果良好。

表1 高效液相色譜法對花生中AFB1的測定Table 1 Determination of AFB1 in peanuts by HPLC

表2 高效液相色譜法對玉米中AFB1的測定Table 2 Determination of AFB1 in corns by HPLC

2.2 酶聯(lián)適體法檢測AFB1

采用酶聯(lián)適體法檢測AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=-0.01x+0.957 05(R2=0.990 1)，線性范圍為1～80 ng/mL，檢出限為0.7 ng/mL。采用酶聯(lián)適體法對花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表3和表4，花生中AFB1回收率為85.40%～94.40%，玉米中AFB1回收率為81.00%～86.70%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，且效果良好。

表3 酶聯(lián)適體法對花生中AFB1的測定Table 3 Determination of AFB1 in peanuts by enzyme-linked aptamer method

表4 酶聯(lián)適體法對玉米中AFB1的測定Table 4 Determination of AFB1 in corns by enzyme-linked aptamer method

2.3 適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測AFB1

采用適體轉(zhuǎn)換熒光法檢測AFB1并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.759 87x+148.928 30(R2=0.996 0)，線性范圍為1～300 ng/mL，檢出限為0.8 ng/mL。采用適體轉(zhuǎn)換熒光法對花生、玉米進(jìn)行AFB1的加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表5和表6，花生中AFB1回收率為99.00%～108.33%，玉米中AFB1回收率為81.00%～85.56%。表明該方法可行，能抵抗其他常見高濃度生物毒素的干擾，效果良好。

表5 適體轉(zhuǎn)換熒光法對花生中AFB1的測定Table 5 Determination of AFB1 in peanuts by aptamer conversion fluorescence method

表6 適體轉(zhuǎn)換熒光法對玉米中AFB1的測定Table 6 Determination of AFB1 in corns by aptamer conversion fluorescence method

2.4 3種檢測方法的對比研究

酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測AFB1的對比結(jié)果如表7所示。3種檢測方法均呈現(xiàn)較好的回收率。從檢出限看，高效液相色譜法低于其他兩種檢測方法，說明作為精密儀器的高效液相色譜較其他兩種檢測方法靈敏度更好。從線性范圍看，核酸適體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換熒光法較高效液相色譜法更廣泛。對3種方法檢測30個樣品所需時長進(jìn)行對比，高效液相色譜法檢測1個樣品需40 min，總時約20 h，而基于核酸適體所建立的兩種檢測方法對30個樣品的檢測可同時進(jìn)行，時長不超過6 h。綜上所述，基于核酸適體所建立的兩種檢測方法在靈敏度上稍弱于高效液相色譜法，但因為檢測時間短，因此在大批量樣品篩查檢測中具有極大優(yōu)勢。

表7 基于核酸適體的檢測方法與高效液相色譜法檢測AFB1結(jié)果對比Table 7 Comparison of aptamer-based detection method and HPLC in the detection of AFB1

采用3種方法對不同加標(biāo)濃度的花生和玉米樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表8和表9。當(dāng)花生加標(biāo)量為60 μg/kg時，酶聯(lián)適體法與適體轉(zhuǎn)換熒光法無顯著性差異，適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法無顯著性差異；當(dāng)花生加標(biāo)量為5、20 μg/kg時，3種方法之間均無顯著性差異。當(dāng)玉米加標(biāo)量為5、20、60 μg/kg時，3種方法之間均無顯著性差異。說明酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法用于檢測AFB1是可行性。

表8 3種方法對不同加標(biāo)濃度的花生中AFB1的檢測結(jié)果Table 8 Detection result of AFB1 in peanuts by three methods μg/kg

表9 3種方法對不同加標(biāo)濃度的玉米中AFB1的檢測結(jié)果Table 9 Detection result of AFB1 in corns by three methods μg/kg

3 結(jié)論

將酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測AFB1進(jìn)行了比較，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并通過統(tǒng)計學(xué)分析得知：3種檢測方法均呈現(xiàn)較好的回收率，酶聯(lián)適體法、適體轉(zhuǎn)換熒光法與高效液相色譜法檢測玉米中AFB1的結(jié)果相比無顯著性差異(P>0.05)，表明基于核酸適體酶聯(lián)適體法和適體轉(zhuǎn)換熒光法是可行的，且檢測時間短，在大批量樣品篩查檢測中具有極大的優(yōu)勢。