北沙參不同部位提取物鎮(zhèn)咳祛痰作用研究＊

何軍偉，朱繼孝，楊 麗，張壽文，程 訪，曾金祥，鐘國躍＊＊

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜（Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq.）為多年生草本植物，生長于海邊沙灘或栽培于肥沃疏松的沙質(zhì)土壤，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古赤峰、山東萊陽及河北安國。北沙參為該植物的干燥根，又稱萊陽參，夏、秋二季采挖，直接洗凈陰干或除去須根后沸水燙制，去皮或不去皮[1-3]。北沙參為傳統(tǒng)常用的大宗中藥材，其味甘、微苦，性微寒，養(yǎng)陰清肺、益胃生津，主要用于肺熱燥咳等[1]。該藥材也在蒙醫(yī)藥學(xué)中廣泛使用，藥用歷史悠久，其蒙文音譯漢文名為“查干-掃日勞”，具有清肺、止咳等功效，主要用于治療肺熱咳嗽等疾病[4]，可知鎮(zhèn)咳和祛痰是北沙參最主要的功效之一。臨床上，含有北沙參藥材的中成藥較多，如掃日勞清肺止咳膠囊、北沙參四味湯、七味沙參湯散、八味檀香散，其中掃日勞清肺止咳膠囊為重要的蒙藥復(fù)方，近年來每年的銷售額超過一億元。

據(jù)報(bào)道[5-19]，北沙參提取物或萃取部位具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)咳、祛痰、細(xì)胞毒性、酶抑制活性等藥理作用。此外，屠鵬飛等[8]采用小鼠模型評價(jià)了多種中藥沙參（包括北沙參）類的鎮(zhèn)咳、祛痰作用，結(jié)果表明北沙參乙醇提取物具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳作用，但其祛痰作用較弱。另外，北沙參提取物及其各萃取部位鎮(zhèn)咳、祛痰作用的譜-效關(guān)系尚無報(bào)道。因此，亟需對北沙參乙醇總提物及其各萃取部位進(jìn)行深入的鎮(zhèn)咳、祛痰活性研究，尤其進(jìn)行北沙參的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜與鎮(zhèn)咳、祛痰活性的關(guān)聯(lián)性研究。北沙參具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，包括：苯丙素類、單萜類、簡單酚酸類、聚炔類、揮發(fā)油類等，具有抗炎、細(xì)胞毒性、抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛等藥理作用[15,20-29]。然而，北沙參鎮(zhèn)咳、祛痰的化學(xué)成分、生物活性及作用機(jī)制仍不清楚。本課題組前期從北沙參乙醇提取物中報(bào)道了16 個化學(xué)成分，包括3 個生物堿類（(3S)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(1)、(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-卡巴林-3-羧基(2)、(1R,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-卡巴林-3-羧基(3)）、4 個 苯 丙 素 類（(S)-phenyllactic acid (4)、(S)-phenyllactic acid methyl ester (5)、 scopoletin(6)、isopimpinellin(7)）、4 個 簡 單 酚 酸 類（catechol(8)、salicylic acid(9)、 4-hydroxyphenethyl alcohol (10)、vanillic acid 1-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]ester(11)）、1 個 鄰 苯 二 甲 酸 酯 類（dibutyl phthalate(12)）、3 個 聚 炔 類（falcarinol(13)、falcarindiol(14)、(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol(15)）和1 個脂肪酸類化合物（9-hydroxystearic acid (16)[30]。此外，還對上述分離得到的所有化合物進(jìn)行詳細(xì)的化學(xué)分類、以及在進(jìn)化過程中的親緣性進(jìn)行了推測和系統(tǒng)的分析。

北沙參為常用中藥材，自1963 年版《中國藥典》始，歷版《中國藥典》均有收載。2015年版《中國藥典》僅對北沙參藥材的【來源】、【性狀】和【顯微鑒別】（橫切面組織特征）項(xiàng)進(jìn)行了描述；《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2010 年版，第三冊）規(guī)定有【來源】、【性狀】、【鑒別】（橫切面組織特征，粉末特征，法卡林醇對照的薄層鑒別，指紋圖譜）、【檢查】、【浸出物】、【含量測定】項(xiàng)。因此，北沙參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極不完善，且其有效成分尚不清楚，亟需對該藥材鎮(zhèn)咳、祛痰的化學(xué)成分、藥理作用、及其關(guān)聯(lián)性進(jìn)行系統(tǒng)地研究。

采用譜-效學(xué)關(guān)聯(lián)性研究對解決中藥及民族藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系具有十分重要的意義[31]。本研究采用灌胃小鼠北沙參總提取物（BSS總）、石油醚萃取部位（BSS-A）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B）、正丁醇萃取部位（BSS-C）和水部位（BSSD），考察北沙參總提取物及其不同極性溶劑萃取部位的鎮(zhèn)咳、祛痰作用，并初步探討了提取物HPLC 指紋圖譜與鎮(zhèn)咳、祛痰作用的關(guān)聯(lián)性，為闡明該藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，也為建立科學(xué)、簡便的質(zhì)量控制體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級別的昆明小鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司），體質(zhì)量在18-22 g 之間，雌雄各半，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 試劑與材料

咳必清（批號：130304，上海全宇生物科技內(nèi)鄉(xiāng)制藥有限公司）；氯化銨（批號130517）、濃氨水（批號131011）、碳酸氫鈉（批號120219）（西隴化工股份有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)中所用北沙參藥材來自內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，經(jīng)鑒定為傘形科珊瑚菜屬珊瑚菜（G.littoralis）的干燥根。

1.1.3 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI，步琦公司，瑞士）、高效液相色譜儀（SHIMADZU，島津公司，日本）、超聲波清洗器（KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司，中國）、紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800，島津公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北沙參提取物制備

干燥的北沙參藥材（10.0 kg）、粉碎，依次用80%（100 L）、40%（100 L）的乙醇常溫滲濾提取，合并提取液，減壓蒸除乙醇，得深褐色總浸膏（BSS 總，2.14 kg）。然后，將BSS總?cè)苡谝欢康乃?，分別用不同極性溶劑等體積萃取5次，減壓蒸除溶劑，依次得到石油醚萃取部位（BSS-A，58.0 g）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B，22.5 g）、正丁醇萃取部位（BSS-C，121.1 g）和水部位（BSS-D，1 799 g）。以上提取物用一定量的水溶解，配置成低劑量為1.0 g·kg-（1按生藥量計(jì)算）和高劑量為2.0 g·kg-1混懸液，備用。

1.2.2 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)

將120 只小鼠隨機(jī)的分為12 組，每組10 只：正常組，咳必清組，及10個藥物組，即BSS 總組、BBS-A 組、BSS-B 組、BSS-C 組、BSS-D 組的高、低劑量組。自由飲食飲水，連給藥3 d。采用濃氨水噴霧法[32]，嚴(yán)格按照文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，并記錄每只小鼠在接受噴霧濃氨水后2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

1.2.3 祛痰實(shí)驗(yàn)

12 組小鼠均自由飲食飲水，連給藥3 d。采用小鼠氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn)法[32]，嚴(yán)格按照該文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每只小鼠酚紅排泄量。

1.2.4 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC指紋圖譜色譜條件

色譜柱：島津反相分析色譜柱（IntertSustain C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇（B），兩相溶劑中均加入0.1%甲酸，梯度洗脫（0-8 min，5%-5%B；8-10 min，5%-15% B；10-12 min，15%-20% B；12-35 min，20%-30%B；35-45 min，30%-50%B；45-53 min，50%-75%B；53-63 min，75%-95%B；63-65 min，95%-100% B；65-80 min，100%-100% B）；進(jìn)樣量：30 μL；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃。

1.2.5 供試品溶液的配置

依次配置 100.0、20.0、20.0、20.0、20.0 mg·mL-1的BSS 總、BSS-A、BSS-B、BSS-C 和 BSS-D 溶液，高速離心，取上清液至棕色安培瓶中，備用。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0 軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，組間比較t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 北沙參總提取物及各萃取部位對模型小鼠的鎮(zhèn)咳作用

由表1可知，與正常組比較，北沙參總提取物在低和高劑量、BBS-A 在低和高劑量、及BBS-B 在高劑量下均能顯著地減少模型小鼠在2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)（P<0.01），即顯示出較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳作用，并強(qiáng)于陽性對照藥咳必清。此外，與正常組比較，BBS-B 在低劑量、BBS-C 在高劑量、及BBS-D 在低和高劑量下均能有效的減少模型小鼠在2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)，但不顯示出顯著性的差異性（P>0.05）。

表1 北沙參總提取物及其各萃取部位對小鼠的鎮(zhèn)咳作用（-x ± s，n=10）

2.2 北沙參總提取物及不同萃取部位對模型小鼠的祛痰作用

由表2 可知，與正常組比較，BBS 總及其四個萃取部位（除BBS-A 低劑量）在低和高劑量下均能有效地增加模型小鼠的酚紅排泄量。其中，BBS總在低劑量、BBS-A 在高劑量、BBS-B 在低和高劑量、BBS-C 在低劑量、及BBS-D 在低和高劑量下均能顯著地增加模型小鼠的酚紅排泄量（P<0.01 或P<0.05），即顯示出較強(qiáng)的祛痰作用。此外，BBS-C 在低劑量下表現(xiàn)出最強(qiáng)的祛痰作用，為主要的有效部位。

2.3 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC指紋圖譜

由圖1可知，北沙參總提取物具有豐富的色譜峰，并具有較好的分離度。此外，各萃取部位之間有一定的交叉情況，可能是導(dǎo)致上述的鎮(zhèn)咳、祛痰藥理作用分散的重要原因。根據(jù)表1 和表2 的藥理結(jié)果表明，北沙參鎮(zhèn)咳作用的有效部位主要是極性中等偏小的部位，即石油醚和乙酸乙酯萃取部位。同時，北沙參祛痰作用的有效部位主要是中等偏大的部位，即乙酸乙酯、正丁醇部位和水部位。

3 討論

北沙參為傳統(tǒng)大宗中藥材，藥用歷史悠久，體內(nèi)鎮(zhèn)咳、祛痰作用顯著，可單用或配伍使用，但其相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和譜-效關(guān)系仍不清楚。本研究采用經(jīng)典的鎮(zhèn)咳、祛痰小鼠模型，考察了北沙參乙醇總提取物及其四個不同極性溶劑萃取部位對模型小鼠的作用，結(jié)果表明，北沙參鎮(zhèn)咳、祛痰的物質(zhì)基礎(chǔ)是有差異的，也存在一定的關(guān)聯(lián)，即鎮(zhèn)咳作用的有效部位主要是石油醚和乙酸乙酯萃取部位，而祛痰作用的有效部位主要是乙酸乙酯、正丁醇和水部位。屠鵬飛等[8]對市場上10種沙參類中藥材進(jìn)行了鎮(zhèn)咳、祛痰作用的比較研究，表明北沙總提取物具有顯著地鎮(zhèn)咳作用，但其祛痰作用不明顯。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，北沙參總提取物是具有較強(qiáng)的祛痰作用，與文獻(xiàn)[8]得出不一致的結(jié)論，可能是由于藥材產(chǎn)地（山東萊陽）、采收季節(jié)、加工方式、提取溶劑（乙醇溶液）等因素所致提取獲得的北沙參提取物的有效成分的數(shù)量和種類方面的差異。此外，本研究采用HPLC 技術(shù)分析了BSS 總及其四個萃取部位BSS A-D 的色譜峰，并與小鼠鎮(zhèn)咳、祛痰試驗(yàn)進(jìn)行了色譜峰-生物活性關(guān)聯(lián)性分析，表明北沙參鎮(zhèn)咳作用主要是極性中等及中等偏小的化學(xué)成分，而祛痰作用主要是中等及中等偏大的化學(xué)成分，造成生物活性及其分散可能與萃取的手段等過程有關(guān)。結(jié)合本課題組前期對北沙參乙醇提取物的化學(xué)成分研究表明，北沙參發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用的主要成分可能為聚炔類、鄰苯二甲酸酯類和脂肪酸類化合物，而北沙參發(fā)揮祛痰作用的主要成分可能為β-卡巴林生物堿類、苯丙素類和簡單酚酸類化合物[30]。

表2 北沙參總提取物及其各萃取部位對小鼠的祛痰作用（-x ± s，n=10）

圖1 北沙參總提取物及各萃取部位的HPLC圖譜

北沙參為傳統(tǒng)大宗中藥材，自1963 年以來歷版《中華人民共和國藥典》均有收載，但該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍不完善。《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2010 年版，第三冊）規(guī)定有【來源】、【性狀】、【鑒別】（橫切面組織特征，粉末特征，法卡林醇（falcarinol）對照的薄層鑒別，指紋圖譜）、【檢查】、【浸出物】、【含量測定】項(xiàng)，【含量測定】項(xiàng)中以法卡林醇（又稱人參炔醇）為指標(biāo)成分，采用HPLC 測定含量，規(guī)定其限量為不得低于0.023%。據(jù)文獻(xiàn)[33-35]報(bào)道，聚炔類可能是北沙參的主要活性成分之一，為該植物中含量最高的一類成分。此外，香豆素類成分報(bào)道也很多，但該類成分的含量較低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北沙參鎮(zhèn)咳部位的主要成分為聚炔類成分 falcarinol、falcarindiol 和(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol，進(jìn)一步提示香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)2010年版中采用法卡林醇作為北沙參藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)具有一定的合理性。然而，對于北沙參祛痰作用的有效成分中的質(zhì)量控制指標(biāo)尚不清楚。此外，來源于北沙參藥材中的多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[9-11,36-38]。因此，需對北沙參藥材中多糖類成分進(jìn)行深入的研究，并確定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控指標(biāo)。據(jù)此，本研究結(jié)果為闡明北沙參鎮(zhèn)咳、祛痰的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)，為該藥材的質(zhì)量評價(jià)的建立提供了一定的參考。