基于蛋白組學(xué)的中醫(yī)藥辨治大腸癌的研究概述＊

郭玲建，祝利民

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，蛋白質(zhì)組[1]是依賴于基因組的直接產(chǎn)物，由基因、細(xì)胞或組織類型表達(dá)的完整蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代興起的新技術(shù)，以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究在個(gè)體發(fā)育的不同階段，正常或異常情況下，各種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，從而闡明基因的功能。鑒定并研究這些差異蛋白在生命過程中的作用，對(duì)疾病防治、藥物開發(fā)具有重大意義。

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是全球常見的惡性消化道腫瘤之一，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新的全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]顯示，大腸癌在全球癌癥死亡率和發(fā)生率中皆居第三位。在我國(guó)國(guó)家癌癥中心[3]收集的數(shù)據(jù)表明大腸癌死亡率位居前五，發(fā)病率緊隨肺癌、胃癌之后，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。大腸癌患者的治療以手術(shù)和化療為主，放療、免疫治療、靶向治療和中醫(yī)藥治療多種治療手段相結(jié)合，其中中醫(yī)藥療法貫穿患者治療的全過程，在增效減毒[4]、預(yù)防轉(zhuǎn)移、降低復(fù)發(fā)率及提高患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等方面具有良好效果。蛋白組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一部分，從微觀研究到宏觀表征，整體的、系統(tǒng)的解析生命過程的研究特點(diǎn)與中醫(yī)藥的“整體觀”、“辨證法”、“動(dòng)態(tài)性”的理念不謀而合，使得傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究能夠以蛋白水平的強(qiáng)大生命科學(xué)技術(shù)為依托，輸出中醫(yī)藥治療大腸癌的“微觀”機(jī)理并深入找尋其作用機(jī)制反饋于臨床[5-6]。蛋白組學(xué)技術(shù)運(yùn)用于中醫(yī)證候、中藥作用機(jī)制的研究成為趨勢(shì)，故本文從中醫(yī)學(xué)的核心思想“辨證”（中醫(yī)證候）、“論治”（中藥作用機(jī)制）兩個(gè)角度對(duì)蛋白組學(xué)的大腸癌中醫(yī)藥研究進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為大腸癌的現(xiàn)代化研究提供參考。

1 中醫(yī)證候

證候是指機(jī)體正邪斗爭(zhēng)的動(dòng)態(tài)過程中的某一階段的病理體征和主觀癥狀的概括，具有系統(tǒng)性、空間性、時(shí)相性[7]的特點(diǎn)。蛋白組學(xué)是以細(xì)胞或組織不同時(shí)間和環(huán)境的蛋白質(zhì)總體為研究對(duì)象，在蛋白水平整體地揭示疾病發(fā)展過程中蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，這與中醫(yī)辨證的核心理念“整體觀”、證候演變的“動(dòng)態(tài)性”極為相似。因此應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)研究大腸癌證候，有利于闡明其本質(zhì)，揭示機(jī)體病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.1 異病同證

從不同疾病的同一證型探索大腸癌是辨證分型客觀化的角度之一。季青等[8]為探索大腸癌和肝癌“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)，分別采集肝腎陰虛證和無證可辨的大腸癌、肝癌患者的血漿并提取蛋白，利用同位素相對(duì)標(biāo)記、iTRAQ 標(biāo)記和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定，結(jié)果顯示大腸癌術(shù)后與肝癌術(shù)后肝腎陰虛證組共同的差異蛋白有8個(gè)。這些蛋白主要與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑有緊密聯(lián)系，KNG1、HBA2 等蛋白可能是大腸癌和肝癌“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本課題組[9]前期還做了大腸癌與肝癌術(shù)后肝腎陰虛證的代謝組學(xué)研究，結(jié)果顯示二者的共同代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸和丙氨酸，其代謝調(diào)控以氨基酸降解為主。

1.2 同病異證

縱向研究同一疾病的不同證候是中醫(yī)認(rèn)識(shí)大腸癌的另一角度。徐玉芬等[10]利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析對(duì)輔助治療期大腸癌脾氣虛證、胃陰虛證、平和證型患者的血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，篩選出13個(gè)表達(dá)有顯著差異的蛋白質(zhì)，其中血紅素前體、α-1-B-糖蛋白、色氨酸羥化酶-1、結(jié)合珠蛋白在胃陰虛證、脾氣虛證患者血清中表達(dá)均上調(diào)，α-2-糖蛋白1 表達(dá)下調(diào)，胰蛋白酶抑制劑HI30、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白在胃陰虛證患者中表達(dá)上調(diào)，在脾氣虛證患者中表達(dá)無顯著差異。結(jié)果表明大腸癌輔助治療期脾氣虛證、胃陰虛證形成存在不同的分子基礎(chǔ)，可作為辨證論治的潛在客觀指標(biāo)。孫校男等[11]收集了輔助治療期結(jié)腸癌濕熱證、脾虛證及無癥狀患者的血清各8 例，進(jìn)行雙向凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示濕熱證組較無癥狀組維生素D結(jié)合蛋白升高，血清結(jié)合素前體、β-解離抑制因子（β-GDP）、載脂蛋白A-I前體和簇蛋白均降低。脾虛證組較無癥狀組β-GDP、簇蛋白及血清結(jié)合素前體升高，前白蛋白原、載脂蛋白A-I 前體及維生素D 結(jié)合蛋白均降低，表明這6 種差異表達(dá)蛋白的組合性變化可能是輔助治療期結(jié)腸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。程德金[12]應(yīng)用iTRAQ 標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)健康人及大腸癌脾虛證和濕熱證患者間的唾液蛋白進(jìn)行定量，結(jié)果顯示大腸癌脾虛證患者與健康人間的差異蛋白有378個(gè)；大腸癌濕熱證患者與健康人間的差異蛋白有493個(gè)；大腸癌濕熱證與脾虛證間的差異蛋白分別有299個(gè)、414個(gè)，共有的差異蛋白為79個(gè)。

1.3 同病單證

對(duì)同一疾病單一證候的研究是辨識(shí)大腸癌證候分子機(jī)制的有效手段。孫校男等[13]收集大腸癌輔助化療期血瘀證、脾虛證及平和質(zhì)患者血清各8例，進(jìn)行雙向凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示在血瘀證及脾虛證大腸癌患者中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白、觸珠蛋白、微管蛋白α鏈3、β-二磷酸鳥苷（β-GDP）、血清載脂蛋白A-I均高表達(dá)，凝血酶原、二氫葉酸還原酶樣蛋白質(zhì)、血管生長(zhǎng)因子受體-1、腫瘤蛋白DJ-1 在血瘀證中高表達(dá)但在脾虛證中低表達(dá)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子G-1、白細(xì)胞介素-27α 在血瘀證患者中低表達(dá)而在脾虛患者中高表達(dá)，表明這11 種差異表達(dá)蛋白的組合性變化可能是大腸癌血瘀證的物質(zhì)基礎(chǔ)。周小軍等[14]為從蛋白質(zhì)水平探討大腸癌濕熱蘊(yùn)結(jié)證的本質(zhì)，采用雙向凝膠電泳法分離30 例大腸癌濕熱蘊(yùn)結(jié)證患者腫瘤組織和20 名正常人結(jié)腸黏膜組織的蛋白質(zhì)，鑒定出20個(gè)差異蛋白。大腸癌濕熱蘊(yùn)結(jié)證與對(duì)照組比較，有15個(gè)蛋白上調(diào)，5個(gè)蛋白下調(diào)，表明大腸癌濕熱蘊(yùn)結(jié)證患者和健康人的蛋白質(zhì)表達(dá)具有差異，為在蛋白質(zhì)水平研究濕熱蘊(yùn)結(jié)證本質(zhì)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。白玉茹[15]為探尋脾虛濕盛型大腸癌的客觀依據(jù)，選取23例經(jīng)病理確診的脾虛濕盛型大腸癌患者的組織進(jìn)行iTRAQ 定量蛋白鑒定并進(jìn)行生信分析和WB 驗(yàn)證。結(jié)果顯示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 這六個(gè)差異蛋白經(jīng)WB 驗(yàn)證與iTRAQ 結(jié)果一致，為脾虛濕盛型大腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的研究提供了新的線索。

在大腸癌中醫(yī)證候的蛋白組學(xué)研究中，研究者多以人體血清、組織為樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組檢測(cè)和生信分析，探索以證候?yàn)橹行牡摹爱惒⊥C”、“同病異證”、“同病單證”的物質(zhì)基礎(chǔ)，為大腸癌證候辨識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化提供量化依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)臨床診療和預(yù)后具有重要意義。

2 中藥作用機(jī)制

蛋白組學(xué)作為后基因組時(shí)代興起的新技術(shù)，將其引入中藥研究，以蛋白表達(dá)差異的直觀方式闡述中藥作用于機(jī)體的機(jī)制，擺脫“經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)”的桎梏，推動(dòng)中藥治療疾病的現(xiàn)代化研究。蛋白組學(xué)是高通量的信息集合，結(jié)合蛋白組學(xué)研究大腸癌的中藥治療，有利于尋找中藥作用于大腸癌的位點(diǎn)，更深入的認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制，應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

2.1 中藥復(fù)方

陳純輝[16]為觀察大黃?蟲丸是否通過改善肝臟的纖維化狀態(tài)來抑制大腸癌的肝轉(zhuǎn)移，采用無標(biāo)記比較蛋白組學(xué)對(duì)MC38-EGFP 細(xì)胞在C57BL/6J小鼠體內(nèi)衍生的外切體進(jìn)行分析。結(jié)果顯示大黃?蟲丸能夠顯著降低肝臟趨化因子2（CCL2）及其受體CCR2 的表達(dá)，減少荷瘤小鼠肝臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕M2 極化，減少F4/80 陽(yáng)性面。說明大黃?蟲丸通過抑制CCL2介導(dǎo)的M2 偏斜范式，改善促纖維化微環(huán)境，抑制大腸癌肝轉(zhuǎn)移。

2.2 中藥有效成分

已有報(bào)道姜黃素是包括大腸癌在內(nèi)的多種癌癥類型中的有效化學(xué)預(yù)防和治療劑，Sato 等[17]為進(jìn)一步了解其如何發(fā)揮抗癌活性，使用SW480和SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。結(jié)果鑒定出39 種姜黃素調(diào)節(jié)的磷蛋白，其中5種參與癌癥信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)一步分析表明mTORC1和p53信號(hào)通路是姜黃素的主要靶標(biāo)。Tai 等[18]使用絞股藍(lán)皂苷（GpS）治療Apc(Min/+)大腸癌模型小鼠，證實(shí)GpS 可顯著減少小鼠中的腸息肉數(shù)量和大小，并進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，鑒定了GpS 處理后的40 種差異表達(dá)蛋白，這些蛋白大多與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)有關(guān)，經(jīng)WB 驗(yàn)證了與其有關(guān)的Peroxiredoxin-1、Peroxiredoxin-2 的上調(diào)及 Raf-1 的下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)GpS 可增強(qiáng)5-氟尿嘧啶（5-FU）的抗癌功效。強(qiáng)調(diào)了GpS 作為抗癌藥的潛力及其抗癌的潛在機(jī)制，和在結(jié)直腸癌化療中作為5-FU 佐劑的作用。雷公藤甲素是一種二萜類三環(huán)氧化物，提取自中草藥雷公藤。Liu 等[19]使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究雷公藤甲素處理的結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示雷公藤甲素引起了與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白14-3-3 epsilon 的裂解和核周移位，表明雷公藤甲素可能值得作為結(jié)腸癌的潛在治療劑進(jìn)行研究，其抗癌作用可能與14-3-3ε 的改變有關(guān)。薯蕷皂苷提取于穿龍薯蕷，是抗結(jié)腸癌的有效藥物。Chen 等[20]采用iTRAQ 技術(shù)研究薯蕷皂苷處理與未處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，鑒定出288個(gè)差異表達(dá)蛋白。結(jié)果表明薯蕷皂苷誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞毒性的分子機(jī)制與氧化磷酸化、Wnt、p53和鈣信號(hào)通路有關(guān)。

2.3 有效成分衍生物

Kim 等[21]為檢測(cè)人參皂苷的衍生物-新型人參皂苷(G-Rp1)的抗增殖和促凋亡活性的分子靶標(biāo)，進(jìn)行了二維凝膠電泳蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示G-Rp1 明顯上調(diào)了結(jié)腸癌Lovo 細(xì)胞中的SNU-407、DLD-1、SNU-638、AGS、KPL-4、SK-BR-3和Apo-A1的蛋白水平，通過敲除Apo-A1 的小干擾RNA 上調(diào)了ADP-核糖和p53 的水平，并抑制了Lovo 細(xì)胞的增殖，表明GRp1 可能通過上調(diào)Apo-A1 抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，從而發(fā)揮抗癌作用。雙青蒿素是青蒿素衍生物，Lu等[22]在前期研究中建立了結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 的雙青蒿素耐藥株HCT116/R，并對(duì)HCT116/R 的抗增殖和耐藥特性進(jìn)行了蛋白組學(xué)研究，鑒定出8 個(gè)差異表達(dá)蛋白，結(jié)果表明雙青蒿素可能不會(huì)誘導(dǎo)結(jié)腸癌的多藥耐藥表型，且為進(jìn)一步研究其抗癌機(jī)制提供了新的線索。

中藥復(fù)方抗大腸癌的蛋白組學(xué)研究較少，中藥有效成分治療大腸癌的蛋白組學(xué)研究是當(dāng)前熱點(diǎn)，其中青蒿素[23]及其衍生物[22,24]、姜黃素[17,25-28]、雷公藤甲素[19,29-30]的研究較多，同時(shí)常見食物提取物[31-36]對(duì)大腸癌的“食療”作用也得到了更多關(guān)注。

3 小結(jié)與展望

蛋白組學(xué)的發(fā)展為中醫(yī)藥認(rèn)識(shí)和治療大腸癌提供了新思路，拓展了新方法，在一定程度上挖掘了中醫(yī)藥與大腸癌的科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)了中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的匯通，但仍存在不足之處。大腸癌證候的蛋白組學(xué)研究多圍繞差異表達(dá)蛋白獨(dú)立的生物學(xué)意義描述，若同時(shí)關(guān)注差異表達(dá)蛋白間的互作關(guān)系和多組學(xué)聯(lián)用探索大腸癌證候的分子機(jī)制，不僅將更加貼合中醫(yī)學(xué)“整體觀”的理念，也將提高證候分型量化標(biāo)準(zhǔn)的可靠性、邏輯性。中藥復(fù)方雖在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的應(yīng)用中占主導(dǎo)地位，然由于其化學(xué)成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多、研究難度大，基于蛋白組學(xué)的中藥復(fù)方抗大腸癌研究較少，因此可以從有效成分或其衍生物入手，對(duì)復(fù)方中的主要有效成分進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，然后通過生物信息分析等手段整合，以“化整為零-歸零為整”方式運(yùn)用蛋白組學(xué)進(jìn)行中藥復(fù)方抗大腸癌的機(jī)制研究，做到“病與藥”的結(jié)合。

蛋白組學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[37]是現(xiàn)有研究手段中的熱點(diǎn)，因此本文系統(tǒng)回顧了蛋白組學(xué)在中醫(yī)藥抗大腸癌中的主要研究領(lǐng)域。蛋白組技術(shù)遠(yuǎn)比基因組技術(shù)復(fù)雜和困難，蛋白質(zhì)不僅有著復(fù)雜的翻譯后修飾，且蛋白組學(xué)研究需要制備大量的蛋白質(zhì)，因此在蛋白質(zhì)的分離、擴(kuò)增和純化上還存在一定的難度，仍需完善擁有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)。但隨著蛋白芯片、雙向電泳、蛋白質(zhì)譜等技術(shù)的不斷成熟與使用，蛋白組學(xué)技術(shù)將在闡明中醫(yī)藥防治大腸癌機(jī)制上發(fā)揮重要作用，尤其是為本課題組下一階段研究中藥作用于大腸癌的機(jī)制提供了重要的技術(shù)支持。